在过去的十年中，mRNA的化学修饰越来越被认为是控制真核细胞蛋白质合成的重要机制。在特定情况下，这些标记的干扰与癌症、神经疾病、线粒体疾病和糖尿病等疾病有关。然而，由于缺乏精确测量转录组中RNA修饰结合水平的技术，该领域的研究进展缓慢。来自 Nature Biotechnology上的两项研究已经针对两种最常见的mRNA修饰：N6-甲基腺苷（m6A）和假尿苷（Ψ）解决了这个问题。Liu等人介绍了一种不受周围碱基序列和结构影响的定量、转录组范围的m6A作图方法，而Dai等人提出了一种基于先前RNA亚硫酸氢盐测序（RBS seq）方法的稳健、定量Ψ作图平台，这些研究实现了所需的量化和分辨率，从而超越了测量修饰的全局分布，实现了高通量下单个位点的机制研究。
Figure 1 Ψ和m6A mRNA修饰化学计量的转录组范围测量
对单个位点进行RNA修饰与基因调控的关联研究已经相对普遍了，但对于绝大多数位点，修饰产生的表型仍然未知。先驱性研究在真核mRNA中定位了数千个不同的m6A和Ψ位点，并证明在不同的细胞、环境和疾病条件下，修饰在转录组中重新定位。揭示RNA修饰的作用机制和表型效应需要高通量方法，不仅测量各个位点的位置，还测量其占有率（化学计量）。
m6A是第一个在转录组范围内定位的修饰。早期的m6A检测技术在很大程度上依赖于抗体，而最近的方法是基于酶。尽管功能强大，但现有的方法对特定的m6A-序列（例如ACA、GAC）或结构有偏见，并且通常不是定量的。Liu等人的GLORI方法通过脱氨基非甲基化腺苷，使m6A碱基保持完整，并允许通过测序进行检测（图1）。使用GLORI，作者报告了HEK293T细胞在单碱基分辨率下>175,000 m6 A位点。他们在位点上观察到广泛的m6A修饰水平，并报告大多数含m6A的mRNA具有多个位点，位点化学计量中值约为40%。转录物上高化学计量m6A位点的存在与半衰期降低和翻译效率降低相关。正如预期的那样，m6A位点的化学计量学在热休克和缺氧条件下发生变化，这提供了证据表明m6A掺入水平的变化可能会下调特定基因组的表达，以响应细胞条件的变化。
Figure 2 Liu等人的研究成果Ψ，尿苷（U）的C5糖苷异构体，在真核mRNA中几乎与m6A一样丰富，但由于U和Ψ之间化学差异的微妙性，Ψ在转录组范围内的定量受到阻碍。Dai等人提供了一个稳健的定量Ψ映射平台（图1）。作者使用亚硫酸氢盐反应的pH调节来创建亚硫酸氢酯诱导的缺失（BID-seq）方法，该方法提高了Ψ修饰碱基缺失的效率（从5-30%到95%），并抑制了不希望的副反应，即C-U转化。这些改进提高了亚硫酸氢盐Ψ作图的灵敏度和定量能力，使作者能够开始探索特定Ψ位点的生物学。值得注意的是，他们发现Ψ和m6A一样，调节mRNA半衰期。然而，它却反其道而行之。mRNA半衰期的总体分析表明，Ψ的加入适度稳定了转录物。作者还报告了数百个Ψ位点被很好地占据（50–100%化学计量比），并且在细胞系和组织类型之间保守。与之前的报道一致，BID-seq分析表明，Ψ位点在mRNA编码区富集，表明它们可能影响核糖体的蛋白质合成。虽然Ψ和m6A都影响mRNA半衰期并存在于编码区，但Ψ与m6A的不同之处在于，它可以形成可选的（非U/Ψ：A）碱基对。由于核糖体通过mRNA密码子和氨酰基tRNA反密码子之间的碱基配对相互作用来读取mRNA，因此推测Ψ可能会“重新编码”mRNA，类似于肌苷的观察结果，肌苷是另一种能够与多个核碱基进行碱基配对的RNA修饰。与此一致，先前的体外研究发现，含有Ψ密码子的报告mRNA可以通过诱导点突变或通过终止密码子读取10翻译成多个肽序列。
Figure 3 Dai等人的研究成果Dai等人在细胞和组织中研究了这个问题。BID-seq显示，Ψ修饰的终止密码子（ΨAA、ΨAG、ΨGA）存在于100多个小鼠组织转录物中，化学计量学介于10%和65%之间。他们评估了这些终止密码子的一个子集是否可以被重新编码为有义密码子，并发现扩展的蛋白质是由他们检测的10个修饰转录物中的一半产生的。单个修饰的mRNA上的翻译终止密码子的水平在转录本之间和不同组织中不同，从3%到35%不等。这项工作提供了Ψ诱导内源性mRNA序列重新编码的第一个证据，并表明Ψ诱导的重新编码是一种高度依赖于上下文的事件。GLORI和BID-seq都为定量mRNA修饰的化学计量提供了基础工具。虽然这两种方法通常都非常敏感，但与所有方法一样，它们都有局限性。对于某些序列背景下的修饰位点，位点化学计量学的定量受到高水平背景（高达25%的缺失或误掺）和非线性校准曲线的限制。值得注意的是，在来自HEK293T细胞的mRNA中，这两项研究在相似的平均化学计量下检测到543Ψ和>175,000 m6 A位点。m6 A的丰度增加了300倍以上，这与之前的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测量结果不一致，表明Ψ和m6 A通常以相似的丰度存在。需要更多的研究来开发稳健的算法，以限制mRNA修饰位点化学计量学的过度或不足calling。
小结
Dai等人和Liu等人提供了一套期待已久的强大工具，用于生成和测试关于mRNA修饰的生物学作用的假设。Dai等人的工作通过确定内源性mRNA的Ψ记录的存在以及它如何受到修饰化学计量、组织位置和序列背景的影响，说明了这些方法在研究单个修饰位点方面的能力。需要对各种序列背景和组织类型中的修饰进行类似的仔细生化研究，以阐明单个修饰位点的生物学后果。随着方法的不断改进，将其结果与通过独立技术测量的修饰位点的数量相关联将很重要。1.Liu, C., Sun, H., Yi, Y. et al. Absolute quantification of single-base m6A methylation in the mammalian transcriptome using GLORI. Nat Biotechnol (2022).2.Dai, Q., Zhang, LS., Sun, HL. et al. Quantitative sequencing using BID-seq uncovers abundant pseudouridines in mammalian mRNA at base resolution. Nat Biotechnol (2022).
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