为大家推荐一篇发表在JACS上的文章Site-Specific Labeling of Endogenous Proteins Using CoLDR Chemistry，文章的通讯作者是来自以色列魏兹曼研究所的Nir London教授。Nir London教授主要通过理论计算和实验方法来设计和发现新的化合物，用于化学生物学和药物的发现和设计，重点是共价抑制和激酶信号传导。 

使用化学探针对细胞中的天然蛋白质进行选择性修饰是调整和研究蛋白质功能、构象、结构、细胞信号、定位等的有力工具。因此出现了多种方法，包括基因工程方法允许引入荧光域或化学反应域，遗传密码扩展方法使带有生物正交反应柄的非天然氨基酸的位点特异性掺入成为可能，遗传方法的替代方法是化学生物偶联。已经开发了几种化学反应来修饰天然存在的氨基酸，同时控制探针的选择性，用于体外蛋白质标记。

为了选择性地标记内源性蛋白质，开发了包括目标识别部分、反应功能和探针部分（或标签）的各种分子。在这些情况下，传统亲和标记靶向的蛋白质通常会失去其天然活性，因为识别部分永久占据其配体结合口袋。这可能会阻碍对相关细胞过程中蛋白质参与的研究。为了可以保留目标蛋白的活性，还有一些配体导向的化学反应，包括配体导向的甲苯磺酰（LDT），酰基咪唑（LDAI），溴苯甲酸酯（LDBB），磺酰基吡啶，和N-酰基-N-烷基磺酰胺（LDNASA）。在这些生物偶联方法中，配体在与 POI 上的亲核残基形成共价键后离开活性位点。

但是依然存在一些问题，首先，所需的激活基团和接头的大小很大，并且排除了非常靠近活性位点的残基的标记。其次，亲核试剂本身不是理性选择的，因此，很难评估哪个目标适合化学反应。最后，这些化学物质中的一些受到动力学缓慢、细胞环境稳定性低和结构复杂性的影响。因此，需要使用简单且小的反应基团来开发新的配体导向的化学物质以到达所需的位置并特异性标记特定的亲核氨基酸。

在本文中，作者报道了α-取代的甲基丙烯酰胺，它与硫醇亲核试剂反应后，发生共轭加成-消除反应，最终在 α' 位置释放取代基。这些化合物已被用作靶向共价抑制剂，并证明了共价配体定向释放 (CoLDR) 化学可用于“开启”荧光和化学发光探针（图1A）。作者设想反转丙烯酰胺的方向性——将蛋白质靶向部分（识别位点）作为 α' 位置的取代基——配体（通常是抑制剂）再靶向半胱氨酸。这可用于带有各种标签的蛋白质活性位点的位点特异性半胱氨酸标记（图 1B）。

图1

作者通过分别在丙烯酰胺的N端和C端修饰不同的基团，开发了不同的CoLDR探针靶向不同的蛋白，作者基于BTK的一种抑制剂设计了Ibrutinib探针以靶向BTK活性位点，并进而共价连接活性位点周围的活性半胱氨酸（图2)，从而实现了炔基或其它荧光基团的引入，并跟踪了BTK蛋白在体内自然降解的过程，并且作者通过对于BTK 的另一种配体 evobrutinib，以及其他两个可用共价抑制剂的治疗靶点进行修饰证明了对于其它蛋白质靶标也是通用的。

图2

靶向嵌合体(PROTACs)的蛋白质水解是诱导细胞蛋白选择性降解的一种常用方法。先前已经报道了BTK的共价和非共价PROTACs，作者进一步验证是否可以跟踪BTK PROTAC诱导的靶向降解，表明了protacac介导的降解可以通过使用CoLDR荧光标记预标记目标(图3)，使用凝胶荧光跟踪。表明了荧光标记不干扰非共价PROTAC的结合，也不干扰与CRBN E3连接酶的三元复合体的形成。

图3

总之，作者使用了先前报道的 CoLDR 化学方向的逆转允许对感兴趣的天然蛋白质进行位点特异性细胞标记，同时保留其酶活性。

本文作者：ZLQ

责任编辑：ZLQ

原文引用：https://doi.org/10.1021/jacs.1c06167