荧光成像可以揭示细胞内蛋白质分子和核酸分子的空间信息，但是荧光光谱的重叠限制了检测目标的数目，阻碍了理解设计多种生物分子的复杂生物的功能。目前有几种策略可以利用DNA技术和纳米结构优越的可编程性来克服这一局限性，但在实践中，由于这些DNA设计的复杂性，实现这些多重检测方法的广泛采用仍然具有挑战性。据此，本文的作者发展了一种依赖于简单的线性核酸设计的多重标记方法，称为变色荧光条形码法（CCFB）。

CCFB发射的颜色是通过链置换反应的核酸杂交决定，通过CCFB的颜色顺序可以区分多种分子(如图1a)。比如CCFB的颜色从红到黄到绿可以和CCFB从黄到红到绿区分开。使用荧光显微镜观察每个CCFB标记的靶标的颜色变化（如图1b)。可检测生物分子的数量根据CCFB构成组分的数量呈指数增加。当使用M种荧光团(限于五种，因为光谱重叠)并且它们的荧光变化N-1次(N ≥ 2)时，可以区分M的N次方个分子。此外，CCFBs具有非常简单的结构，因此不需要大量的探针和复杂的序列设计。并且不需要洗涤步骤，因为荧光基团会被连接到互补寡聚物上的猝灭基团猝灭。因此，与通常需要洗涤、杂交和去杂交的许多操作的其他方法相比，用CCFB可以更简单和更快速地成像。作者使用无环的D-苏氨酸核酸，D-aTNA作为CCFBs的组分（如图1c)。D-aTNA可以形成非常稳定的同源聚合体，但是不会和DNA或者RNA稳定杂交。此外相比于DNA探针还具有更高的信噪比。在本文中，作者验证了CCFB多种功能，并展示了其在蛋白质检测中的应用。

作者首先设计了一个具有三个可分辨荧光团Cy5、Cy3和FAM的CCFB系统，可改变发射颜色两次（如图2a）。CCFB复合物由荧光链（F1、F3和F5），将荧光基团和猝灭基团栓系在两端的连接链（F2和F4）。CCFB复合物的颜色序列可以通过依次添加三条猝灭链Q1、Q2和Q3来解码，这三条链分别与F1、F2和F3完全互补。每种Q链的添加可以产生完全互补的双链，F链的荧光团被猝灭。因此不需要清洗步骤。作者首先研究了条形码复合物的变色能力，其中D-aTNA F链彼此形成7-mer双链。在20℃的条件下进行Cy3→ Cy5→FAM barcode的颜色转变（如图2b）,还检测了其他27个barcode的颜色变化。当添加Q链时，荧光颜色根据预定顺序改变。并且，生产这27个条形码只需要14条D-aTNA链，这证明了CCFB方法的效率。

为了证明CCFB的多重成像能力，作者将在7-聚体D-aTNA修饰在聚苯乙烯珠上，并进行了荧光显微镜成像。D-aTNA链上修饰生物素，使其能够固定在链霉亲和素修饰的珠子上（如图3a)。加入适当的F链使得barcode是Cy5→Cy3→FAM 。在初始状态下，荧光成像仅显示Cy5发射，证实了复合物在珠子上的形成（如图3b,c）。添加Q1使Cy3发射，添加Q3使FAM荧光。在其他条形码上观察到不同的颜色变化（Cy3→Cy5→FAM 和 FAM→Cy5→Cy3）（如图3d,e），整个过程只需要三分钟。定量分析证实了这些变化（如图3f）的种群，对应两种颜色和两种寿命。通过机器学习的自动聚类，识别出不同的群体，并返回到图像空间，根据每个像素在相量空间中所属的组来标记每个像素。

接下来，为了验证CCFB方法的多重检测能力，作者评估了是否可以同时区分九种不同条形码的珠子（如图4a）。制备了具有不同颜色序列的条形码珠子混合物。每个珠子都呈现出不同的颜色变化（如图4b）。作者通过监测颜色变化（如图如图4c）对条形码进行解码，并证明即使只使用了三个荧光团，所有九个条形码都可以清晰的区别开来（如图4d)。

接下来，作者使用了CCFB去检测细胞中的蛋白 。D-aTNA复合物首先连接上phalloidin，phalloidin是一种与F-肌动蛋白结合的双环肽（如图5a）。Cy5→Cy3→FAM的barcode通过于D-aTNA链杂交连接到phalloidin上，将该复合物添加到多聚甲醛固定的HeLa细胞孵育30分钟后获得初始荧光图像（如图5b）。观察到丝状图案，表明phalloidin与F-肌动蛋白结合。Q链的加入导致了预期顺序的颜色变化（如图5c,d）。因此，CCFB标记可用于细胞内蛋白质成像。

接着作者研究了CCFBs在免疫染色法中的适用性（如图6a,b）。为了验证CCFB系统可以检测到该蛋白，作者首先选择定位于高尔基体的Golgin-97作为靶蛋白。固定的HeLa细胞的荧光显微镜图像显示高尔基体发出Cy5荧光（如图6c）。定位在其他细胞器中的蛋白质也可以通过CCFB标记可视化。当用与Cy5→FAM→Cy5条形码结合的抗兔抗体检测XBP1（位于核仁）时，从核仁中观察到了发射（如图6d）。类似地，RPA32是一种已知定位于细胞核的蛋白质，使用带有FAM→Cy5→Cy3条形码的抗鼠抗体成功地可视化（如图6e）。这些实验明确证实了CCFB系统能够正确检测目标蛋白，并表明与CCFB的结合不会干扰抗体结合。最后，对三种蛋白质的多重免疫染色进行了评估。使用具有不同颜色序列的三种抗体，同时对固定的HeLa细胞进行Golgin-97、XBP1和RPA32的免疫染色。通过添加Q链进行CCFB成像（如图6f）。在每个细胞器中观察到不同的荧光变化(如图6g)。这些结果表明，我们的CCFB系统可以用于细胞中的多重蛋白质检测，以克服可分辨荧光团数量的限制。

在这项研究中，作者描述了一种新的多重标记方法的开发和验证。与使用DNA纳米结构的荧光条形码标记方法（超过1兆道尔顿）相比，CCFB系统更加紧凑（总双链长度为42个碱基对，小于30 kDa）。证明了CCFB方法可以用于多种蛋白质成像，并且使用CCFB进行免疫染色的方案不需要重复的染色步骤。总之，CCFB方法是一种多功能的标记工具，在生物学和纳米技术中具有实用价值。

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c09844