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分享一篇2022年发表在J. Am. Chem. Soc.上的文章,题目是“Photoproximity Labeling of Sialylated Glycoproteins (GlycoMap) Reveals Sialylation-Dependent Regulation of Ion Transport”。文章的通讯作者为普林斯顿大学默克催化中心David W. C. MacMillan教授。
在细胞表面单糖中,唾液酸对细胞功能的影响尤为突出。这种带电荷的糖被唾液酸转移酶结合,通常修饰多糖链的末端。在肿瘤发生过程中唾液酸化似乎可以抑制细胞凋亡,并使细胞逃避免疫系统。尽管有这些观察,其潜在的生化机制仍然知之甚少,部分原因是缺乏高分辨率的工具来评估唾液化的功能作用。因此,需要新的方法来分析唾液化的生化影响。我们假设唾液组(唾液化糖蛋白)和相关相互作用组的化学蛋白质组分析可以提供一些见解。
这篇文章,为了更全面地研究唾液化在癌症中的依赖性变化,作者开发了一种名为GlycoMap光接近标记平台,使其具有识别唾液化细胞表面糖蛋白相互作用组的能力。采用代谢工程的方法用非天然糖Ac4ManNAz代谢标记细胞。随后,利用dbco化的铱催化剂通过SPAAC可得到铱偶联的唾液化糖蛋白。在生物素-二氮嘧啶探针存在的情况下,用蓝光照射局部产生与相互作用的蛋白质交联的卡宾。从而使生物素标记在邻近的与唾液酸化蛋白质相互作用的蛋白质上。
首先作者通过免疫印迹法验证了细胞表面蛋白质的生物素化(图1 B),链霉亲和素珠上的免疫沉淀显示出已知的唾液化糖蛋白Nicastrin (NCSTN)和补体衰变加速因子(CD55)的强烈富集(图1 C)。同时,在三种细胞类型中同时对该策略的可靠性得到验证(图1D)。
图1 唾液化糖蛋白光接近标记策略的验证。
接下来,作者将该策略与基于TMT标签的定量化学蛋白质组学结合,以便全局性识别唾液酸化的细胞表面糖蛋白及其相互作用蛋白质组。作者使用DBCO-biotin来标记唾液酸化糖蛋白,DBCO-iridium + biotin-diazirine来标记唾液酸化糖蛋白及其相互作用蛋白,接着通过streptavidin富集和TMT定量标记,结果中绝大多数(93%)都是已知的糖蛋白(图2B)。条件B(相对于对照)同时富集了唾液化糖蛋白和近端蛋白,因此与条件A(相对于对照)富集的蛋白有65%的重叠。膜蛋白的异四聚体(NCSTN, APH1A, PSEN1, PEN-2)蛋白水解切割成许多完整的膜蛋白,但只有NCSTN被直接唾液化。在这里的数据集中,NCSTN在条件A(与对照组相比)中高度富集(3.8 log2FC),而非唾液化的相互作用子APH1A在GlycoMap分支中高度富集(3.3 log2FC),这表明GlycoMap工作流可以描述唾液化糖蛋白及其相互作用子。
图2体内线粒体靶向和蛋白质标记。
接下来试图研究肿瘤发生中的高唾液酸化事件。为了验证这一点,我们对原发性宫颈癌细胞(PCC)和HeLa宫颈腺癌细胞系进行了比较GlycoMap实验。与之前观察到的上调唾液化一致,化学蛋白组学分析显示HeLa细胞的唾液化(447个富集蛋白)明显高于PCC细胞(223个富集蛋白)(图3)。因此,HeLa细胞中唾液粒的增加产生了更多的相互作用蛋白(HeLa细胞中富集了166个蛋白,而PCC中富集了63个蛋白)。
图3 原代宫颈细胞(PCC)与HeLa细胞的比较蛋白质组学实验。
为了探索这些相互作用的潜在后果,探究了酶促消耗它们的代谢后果(图5A)。在唾液酸酶(VC-Sia)存在或不存在的情况下孵育HeLa细胞,然后对细胞代谢物提取物进行基于质谱的代谢组学定量。虽然大多数代谢物水平受唾液酸酶处理的影响最小,但发现乙醇胺衍生物,包括胞二磷酸乙醇胺(CDP-Etn)、磷酸乙醇胺(P-Etn)和胞二磷酸胆碱(cdp -胆碱)的水平在唾液酸酶处理的细胞中显著升高(图4B)。还研究了唾液酸化对锌摄取的影响(图4C)。锌是通过一系列SLC39家族的溶质载体蛋白通过细胞膜导入的,其中四个在蛋白质组学分析数据集中显示为唾液化(SLC39A6, SLC39A8, SLC39A10和SLC39A14),一个(SLC39A1)与唾液化糖蛋白相互作用。使用比色法测定未处理和唾液酸酶处理的HeLa细胞的锌水平,我们发现VC-Sia处理的细胞锌水平显著升高。这些数据表明,细胞表面的唾液化和/或与唾液化糖蛋白的相互作用在调节细胞锌浓度中起作用。
图4 唾液酸化在肿瘤细胞中的作用。
综上所述,描述了一种新的接近标记平台,以识别唾液化的细胞表面糖蛋白及其相互作用。这种敏感和精确的方法是稳健的和兼容的各种细胞系,包括原代细胞。我们在原代和癌性宫颈细胞系之间的比较蛋白质组学研究表明,唾液化和溶质载体蛋白之间存在显著联系,提示唾液化的新作用。代谢组学数据表明,这些相互作用调节某些溶质载体的功能。
原文链接:https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.2c11094
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