介绍一篇来自“Journal of the American Chemical Society”的文章，题名为“Fluorescence-Based Detection of Fatty Acid β‑Oxidation in Cells and Tissues Using Quinone Methide-Releasing Probes”。

代谢活性的检测使我们能够揭示细胞固有的代谢状态，并阐明细胞稳态和生长的潜在机制。然而，用于研究代谢途径的荧光方法在很大程度上仍未被探索。在此，作者开发了一种新的化学探针，用于基于荧光检测细胞和组织中脂肪酸β-氧化（FAO），这是脂质分解代谢的关键过程。该探针能够检测培养细胞中化学调节剂诱导的FAO活性的变化。该探针进一步用于小鼠肝组织中FAO的荧光成像，并通过FACS和基因表达分析的结合揭示了肝细胞中FAO活性的代谢异质性，突出了它作为脂肪酸代谢研究的化学工具的实用性。

图1

作者设计了一种具有简单分子结构的QM释放探针（图1c）。作者预计，探针将在脂肪酸单元被FAO酶截断，最终释放苯酚，苯酚将通过1，6消除氟离子自发转化为反应性QM（图1c）。然后，释放的QM将被细胞内蛋白质共价捕获，并与炔烃反应手柄上的荧光团进行生物正交连接，从而对FAO活性进行荧光评估。

作者最初合成了QM释放探针1−3，用于检测活细胞中的FAO活性（图2a）。在探针2和3中，将氟引入苯环，以调节探针的水稳定性以及生成的QM的亲电反应性（图2a）。接下来，作者通过LC-MS检测了FAO介导的探针3在活细胞中的降解。如图2b所示，出现了新的峰值，并以时间依赖的方式逐渐增加强度。LC-MS分析显示，这些峰对应于探针3的代谢产物。当用etomoxir预处理细胞时，代谢产物的峰值几乎消失，etomoxir是一种代表性的FAO抑制剂，通过与肉碱棕榈酰转移酶I（CPT1）共价结合，强烈阻断脂肪酸进入线粒体（图2c）。这些结果表明，探针3经过FAO代谢，在活细胞中产生QM。

作者接下来将探针1–3用于ABPP分析以检测活细胞中的FAO活性。结果显示存在与标记蛋白相对应的许多荧光带，并且带强度随着孵育时间的增加而逐渐增加（图3a）。探针3以最高的效率标记蛋白质（图3b）。当用etomoxir预处理细胞时，荧光带几乎消失（图3d）。这些结果表明，探针3主要在线粒体中代谢。作者还合成了带有不同烷基链长度的脂肪酸单元的探针，并评估了它们作为FAO底物的可接受性。结论发现探针3最适合检测活细胞中的FAO活性。

图2

图3

作者进行了化学蛋白质组学分析，以了解QM对细胞蛋白质的反应性（图4a）。总共鉴定了883种蛋白质（log₂（3/DMSO）ratio>2），包括参与FAO途径的几种线粒体酶。结果发现富集蛋白的亚细胞分布为62%的胞质和细胞核（图4b），其次是线粒体（12%）和内质网（6.3%）蛋白。在15kDa处观察到的强荧光带可能归因于胞浆蛋白，如硫氧还蛋白、胱抑素或核糖体蛋白（S20，L34）。为了更深入地了解这种蛋白质组范围的反应性，作者评估了3（图4c）产生的QM在中性水条件下的稳定性。结果表明探针3产生的QM反应性较低。作者推测，这种QM的低反应性排除了它与线粒体蛋白的快速反应，并促进了它在整个细胞中的扩散。

图4

接下来，作者试图使用荧光成像来观察培养细胞中FAO的活性（图5a）。这些对照实验的结果与凝胶内荧光分析的结果一致（图3d）。并且与化学蛋白质组学分析的结果一致，其中探针3产生的QM与不同细胞器中存在的细胞蛋白广泛反应（图4b）。用探针3孵育A549和HeLa细胞，然后进行CuAAC反应，也产生了明亮的荧光图像（图5b）。这些结果证明了探针在荧光成像中的多功能性。作者进一步尝试通过四嗪连接检测FAO活性，而无需细胞固定。为此，合成了带有反环辛烯基团的探针13（图5d）。荧光结果表明被细胞内亲电试剂捕获的QM不容易从细胞中释放。探针3还被进一步用于检测化学调节剂诱导的FAO活性的变化。

图5

FAO在肝脏脂质的储存和消耗方面发挥着重要作用。作者使用探针3检测小鼠肝脏中的FAO活动。如图6a所示，在切片的整个区域上观察到TAMRA的明亮荧光。放大图像显示荧光位于肝细胞内部（图6b）。基于凝胶的荧光ABPP分析结果与从组织切片的荧光成像中获得的结果非常一致（图6c）。

图6

数据显示，从小鼠肝脏分离的肝细胞在用探针3处理后显示出显著的荧光增强，通过用bezafibrate预处理进一步增强（图8c）。为了进一步研究bezafibrate对FAO活性的影响，作者对图7c中定义的FACS组中的肝细胞进行了RNA测序分析。并针对编码FAO相关酶的代表性mRNA进行了实时PCR分析。结果表明，FAO相关mRNA的表达水平与肝细胞的FAO活性密切相关。该探针可以作为一种工具，通过FACS和基因表达分析相结合来阐明细胞中FAO活性的异质性。通过对在肝细胞中高度表达的mRNA进行了基因本体分析，发现FAO活性的增强与PPARα激动剂（如bezafibrate）诱导的肝细胞癌变状态有关。

图

总之，在这项研究中，作者开发了一种新的化学探针3，用于荧光检测细胞中的FAO活性。探针3在检测小鼠肝细胞中FAO活性的异质性方面的实用性得到了进一步证明。这是第一个在小鼠模型中进行荧光FAO检测的例子。这种基于荧光的平台将进一步适用于与脂肪酸代谢相关的生化和生理研究，作为对现有基于质谱的技术的补充分析方法。此外，探针3将通过与单细胞组学分析相结合，有助于了解FAO在单个细胞中的代谢异质性。

本文作者:QHJ

责任编辑:FJY

原文链接:https://doi.org/10.1021/jacs.3c02043

DOI: 10.1021/jacs.3c02043