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为了研究组蛋白上的硫酸化修饰,作者纯化了HepG2细胞的细胞核,使用HPLC-MS / MS搜索酪氨酸硫酸化修饰Ysulf。通过水解肽的质量偏移对照硫酸化修饰,找到了高度关联组蛋白的H3Y99硫酸化修饰。通过二级质谱图和保留时间将该酪氨酸位点上的磷酸化与之区分开来,确定H3Y99位点的硫酸化修饰是新发现的,未被记录的。为了研究H3Y99的硫酸化,作者研发了相应的抗体,并证明了该抗体的可用性和广泛适用性(在多个细胞系进行试验)。
作者根据模拟的核小体八聚体、亚型六聚体、四聚体、二聚体,发现H3Y99的位置被埋在八聚体核小体内,而亚核小体结构有机会招募H3Y99抗体。化学合成了H3Y99sulf的蛋白质,H3Y99sulf抗体与具有H3Y99sulf标记的四聚体和六聚体紧密结合,并且可以被H3Y99sulf肽阻断。
在HepG2中 H3Y99sulf在细胞中的广泛分布,H3Y99sulf主要分布在基因启动子区域,可能是基因转录的未表征标记。
作者通过敲低SULTI家族免疫印迹分析表明,SULT1B1是细胞中H3Y99sulf的主要催化剂,体外硫酸化测定后的免疫印迹测定和HPLC-MS/MS分析证实,SULT1B1可以直接将H3Y99sulf沉积。在CUT&Tag-seq测定时,发现细胞中富含H3Y99sulf的染色质区域的数量和丰度都因SULT1B1耗竭而减少, 这些结果证明SULT1B1可以利用PAPS在细胞中沉积H3Y99sulf。
硫酸基团可以通过提供电子改变酪氨酸的电子性质,这可能导致蛋白质 - 蛋白质相互作用的额外特异性和更高的亲和力。作者合成了三种生物素标记的肽,HepG2细胞的核提取物与合成的肽一起孵育,富集后分析三种肽特异性结合蛋白。其中蛋白甲基转移酶PRMT1是显示出最多的鉴定肽,并与H3Y99sulf肽特异性结合。作者进行了CUT&Tag-seq测定,并鉴定了PRMT1结合峰(FE ≥ 5,P < 0.01),其中61.5%与H3Y99sulf相关,证明了H3Y99sulf和PRMT1之间的全基因组关联。
H3Y99sulf在启动子区域的平均分布在转录起始位点强烈富集,H3Y99sulf和PRMT1共占据的基因启动子区域占PRMT1结合启动子区域的1.6%,表明H3Y99sulf在将PRMT1募集到基因启动子区域方面的关键作用, SULT1B4的减少显著降低了H3R2me6a在基因启动子区域中的分布。PGK8,PDK1和PFKFB1是参与多种信号通路的基因之一,SULT1B1耗竭显著降低了这些基因启动子区域中H9Y99sulf、PRMT1和H4R3me2a的富集,这些基因在细胞系中的mRNA和蛋白质表达也受到SULT8B1减少的抑制。这些结果表明H3Y99sulf在基因转录中的重要作用。
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