分享一篇发表在ChemComm上的文章，文章的题目是“Single-site labeling of histidine in proteins, on-demand reversibility, and traceless metal-free protein purification”，作者是来自印度科学教育与研究所化学系Pralhad Namdev Joshi 和Vishal Rai. 其课题组研究领域为天然蛋白质进行位点选择性标记。如：醛自动氧化实现化学选择性和位点选择性肽和天然蛋白质修饰；通过无金属多组分方法对蛋白质中的赖氨酸进行单位点标记；蛋白质的单位点甘氨酸特异性标记等。
合成探针与天然蛋白的精确生物偶联为调节其功能和治疗特性提供了一个必要的工具。化学方法标记蛋白质需要一种亲电试剂，它可以在接近中性pH和环境温度下的温和反应条件下工作。这种亲电试剂需要表现出化学选择性，并区分一个残基和其他残基。随后，需要从其多个拷贝（位点选择性）中识别一个残基，以实现蛋白质的单位点标记。到目前为止，只有少数亲电试剂能够表现出这种选择性。通常，具有单个Cys的蛋白质通过马来酰亚胺进行单位点标记。His残基在反应性和化学选择性方面都特别具有挑战性。his靶向亲电试剂的主要竞争对手是Cys和Lys。前者由于发生率较低，可以忽略。然而，赖氨酸是一种具有高溶剂可及性的高频残基，因此构成了巨大的威胁。His残基在控制各种生物酶转化的酶结构域中非常丰富。此外，富糖蛋白在血浆中丰富，调节多个过程。重要的是，His是一种中等丰富的残基，对一般蛋白质的结构稳定性并不重要。此外，表面可及的His残基并不参与催化结构域。因此，它是化学修饰和探针安装的良好目标。在这个方向上的早期努力涉及到碘甲烷（1a）来标记His。但是，它对赖氨酸和His表现出很高的反应性，并导致蛋白质的异质标记。在其他亲电试剂中也观察到这种选择性的缺乏（1b-1f，图1a).此外，与未知残基的脱靶反应活性显著。作者首先选取带有单一His残基的泛素（2a）作为模型蛋白，以探索亲电试剂的化学选择性。作者选择了活化的亚甲基亲电键（3a和3b，表1），其极化碳卤键具有σ*受体轨道。碘乙酰胺（3a）不表现出化学选择性，并导致双标记（表1）。随后，作者决定使用极化烯烃来探索π*受体轨道的可能性（3c-3m，表1）。a、b-不饱和砜具有较高的反应性。最后，2-环己烯酮（3m）得到单位点标记泛素（4m），其中胰蛋白酶消化、肽定位和MS-MS证实了H68修饰。2. 2-环己烯酮（3m）标记扩展到结构多样的蛋白质 随后，我们将该方法扩展到结构多样的蛋白质范围，有1到11个His残基（表2）。单个His残基(H15)存在于溶菌酶C（2b）中，也与2-环己酮（3m）具有唯一的反应性(4n，80%的转化率）。其他蛋白质亲核残基包括6个赖氨酸不干扰转化。接下来，作者挑战了区分His与它的多个拷贝（位点选择性）的方法。首先，作者选择了胰岛素（2c），一个5.8 kDa的蛋白，它在一个非常相似的微环境和溶剂可及性中产生两个His残基。作者发现单标记产物（4o），转化率为52%。a-乳白蛋白（2d）包含3个His残基，也导致了单标记蛋白(4p，H68标记，45%的转化率）。最后，作者选择了含有11个His和19个赖氨酸残基的肌红蛋白（2g）。它表现出良好的化学选择性和位点选择性，单标记蛋白（4s，25%的转化率）。通过蛋白质消化、肽定位和MS-MS鉴定了H113修饰位点。3.2-环己烯酮（3m）标记单位点标记组氨酸不影响蛋白活性为了进一步探索，作者研究了在溶菌酶C的情况下标记的含义。标记的溶菌酶C（4n，图2a）的整体二级结构保持保守（图2b）。重要的是，标记位点（H15）并没有阻断催化结构域及其两个关键残基E35和D52（图2a）。因此，其对溶菌微球菌（ML，图2c）的细胞裂解活性仍然不受干扰。同样，RNase A（2e，图fige.2d）的结构在标记后保持保守（图2e）。RNase A在嘧啶核苷酸上水解单链RNA的酶活性主要依赖于H12、H119和K41的组合。作者注意到，RNase A（4q）的标记涉及H105，保留了催化结构域（图2d），其酶活性不受影响（图2f）。接下来，作者将该方法扩展到探针标记。2-环己烯酮（3m）Michael加成生成一个适合形成肟的环酮。用一个19F-NMR标签的氨基氧基衍生物来处理H15标记的溶菌酶C（4n）（5a，图3a）。接下来，将香豆素（5b）的氨基氧基衍生物与4n反应，可以显著转化为荧光团标记的溶菌酶C（6b）。随后，用生物素的氨基氧衍生物（5c）处理4n标记蛋白6c。最后，作者探索了该方法在无金属纯化重组his标记蛋白方面的潜力。作者使用了重组his标记的Ubc9（BL21表达）。细胞裂解液与3m一起孵育3小时。Ubc9是被选择性地标记。将标记的Ubc9从粗细胞裂解液中固定在烷氧胺功能化的树脂珠上。接下来，这些珠子被清洗，以去除任何非共价结合和吸附的蛋白质。随后，用咪唑（1 M）释放固定化的Ubc9。SDS-PAGE分析证实了纯度（图3b）。图3 19f-NMR探针、荧光团和亲和标签的后期安装。在这里，作者报道了2-环己酮（3m）成功地证明了一个单一的His残基可以在一个由天然蛋白呈现的官能团池中被标记。在这里，2-环己酮（3m）可以实现单位点标记，并生成一个官能团，用于感兴趣的探针的正交后期安装。这种亲电试剂的结构简单性确保了它可以应用于一组不同的蛋白质，同时保留其化学选择性和位点选择性。此外，作者还开发了一种化学触发的无示踪去除标签的方法。扩展了蛋白质标记，并提供了一个易于操作的无金属纯方法。原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30620346/原文引用：doi: 10.1039/c8cc08733d
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