JACS|具有偏好性标记蛋白质生物分子的叠氮类小分子

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分享一篇来自“JACS”的文章,名叫“Labeling Preferences of Diazirines with Protein Biomolecules”。这篇文章的通讯作者是来自哈佛大学的Lyn H. Jones研究员和 Christina M. Woo副教授。他们的研究方向分别是分子药理学、蛋白质稳态、化学蛋白质组学和化学基因组学、治疗靶点识别和验证、蛋白质标记化学生物学、共价和基于片段的药物发现;用化学蛋白质组学方法来研究细胞蛋白质组内疗法、天然产物和代谢物的相互作用。

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背景:

    光亲和标记技术 (PAL) 发展以来,PAL 已成为测量生物分子相互作用、蛋白质结构和识别细胞中小分子靶标的关键方法。PAL与高通量测序的结合和基于质谱的蛋白质组学显着增加了从单个实验中测量的信息深度,广泛拓宽了与细胞中蛋白质结合相互作用的范围。尽管使用diazirines作为探针来测量生物分子相互作用,但对diazirine标记偏好的不完全理解限制了这些实验的设计和解释。 


关键数据:

研究从烷基和芳基二氮丙啶与单个氨基酸和单个蛋白质的系统标记偏好进行分析,证明芳基-三氟二氮杂环丙烷主要通过卡宾中间体反应,而烷基二氮杂环丙烷通过反应性重氮中间体过渡,该中间体优先以 pH 依赖性方式与酸性氨基酸反应。特别是,烷基二氮杂环丙烷通过重氮中间体的反应合理解释了膜蛋白和细胞中带负电荷静电表面的蛋白质的优先标记的原因。

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图1:diazirine标记途径的机理图


因此,研究开始评估烷基和芳基二氮杂环丙烷与单个氨基酸的反应性。实验通过Fmoc保护的烷基 diazirine-1与单个氨基酸 (Ac-AA-OMe) 在纯条件下的反应性,来代表 diazirine 和蛋白质之间最接近的可能结合相互作用。Fmoc-diazirine-1以最高产率共价标记相对酸性极性氨基酸,其次是其他极性氨基酸的子集。而芳基二氮杂环丙烷2产生了包含所有 20 个氨基酸的产物,并且半胱氨酸的产量最高。另外,实验评估了氨基酸和二氮杂环丙烷在水溶液中的反应性。烷基diazirine可以检测到高浓度的TyrCys的反应产物,相比之下芳基二氮丙啶2在水溶液中未观察到与任何氨基酸形成高达10 mM的加合物。值得注意的是,芳基二氮丙啶2与 BME (Cys代替物)在 500 mM 下形成的产量与含 1 mM Glu的烷基二氮丙啶3相当。所以,数据表明芳基二氮杂环丙烷2主要通过短寿命的卡宾反应。而卡宾中间体在水溶液中则会被质子淬灭,阻止标记反应的发生。

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图2:烷基和芳基diazirine与20种天然氨基酸的反应性


研究接下来进行了烷基和芳基二氮杂环丙烷在 Tris 缓冲液中超过 5.8–8.0 pH 范围的单个蛋白质牛血清白蛋白 (BSA) 的体外实验的标记效率。类似于单一氨基酸的反应,烷基二氮杂环丙烷3的标记在较低的 pH 值下更高,而芳基二氟二氮杂环丙烷5的标记在所检查的范围内与 pH 无关。这些数据说明烷基 diazirine 和芳基 diazirine 的反应中间体差异可影响在单个底物上观察到的标记效果。

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图3:单个蛋白的光标记的pH依赖性


烷基 diazirine在体外的 pH 依赖性意味着电荷状态将在蛋白质标记中发挥重要作用,并且可以解释不同烷基 diazirine 探针的固有标记效率。实验选用了一组具有净正电荷、负电荷或中性电荷分布的烷基二氮丙啶探针。根据它们在生理 pH 下的总电荷选择了代表性的探针结构,并通过凝胶内荧光评估了它们的标记效率。HEK293T 细胞与 10 μM的单个探针一起孵育,并进行光照射60秒,用于发生标记效果。

正如预期的那样,探针标记效率通常与探针的净电荷相关。带有净正电荷的烷基二氮杂环丙烷探针比中性或带负电荷的探针表现出更高的标记。带正电的JN26与带负电荷的类似物JN33(分别为 819 和 9 种富集蛋白)相比有更加明显的标记蛋白效果。并且,烷基二氮杂环丙烷探针对膜蛋白具有富集倾向。虽然膜蛋白占我们数据集中观察到的所有蛋白质的 33%,其中的46%的膜蛋白至少有 3 倍富集,56%的蛋白至少有 4 倍富集。烷基二氮杂环丙烷探针对膜蛋白的优先标记脂质双层中 Glu 和 Asp这些酸性氨基酸残基。

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图4:PAL探针对细胞进行全蛋白质组光标记


最后,为了进一步评估探针在细胞中的标记趋势,将整个32元烷基二氮杂环丙烷探针库根据探针电荷和结构的相似性分成几组,并给药于 SK-N-SH 细胞进行蛋白质和结合位点作图。带正电荷的探针平均产生418 个 PSM,对应于每个探针 50 个独特的结合位点,而中性探针平均产生 65 个 PSM(14 个独特的结合位点),带负电荷的探针平均产生 14 个 PSM(5 个独特的结合位点),以及发现了大部分结合位点来自膜蛋白(58% 的 PSM)。在所有映射的探针标记的结合位点中,经常观察到两个带负电荷的残基Y67 和 E73的 VDAC1 上的结合位点。

    通过晶体结构图所示,多个 PAL 探针的蛋白质上的结合位点在标记肽周围表现出明显更大的负静电密度(以深蓝色突出显示)。波形蛋白是一种丝状蛋白,经常在烷基二氮杂环丙烷标记实验中发现,因为波形蛋白上存在显着的负静电密度(净电荷 = -27)。同样地,8-12 个 PAL 探针与 VDAC1、ER 伴侣 BiP 和组织蛋白酶 B 结合,每个都在靠近映射的肽结合位点处显示相似的负静电密度。

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图5:32个 PAL探针的结合位点


总结:

该文章阐述了二氮杂环丙烷及其在体外和细胞内与蛋白质生物分子的优先反应模式的系统分析。研究发现烷基二氮杂环丙烷在体外优先以 pH 依赖性方式与酸性氨基酸残基反应。相比之下,芳基-三氟二氮杂环丙烷与所有 20 个氨基酸形成插入产物,对 pH 的依赖性较小,并且标记效果很容易被水淬灭。这些烷基二氮杂环丙烷探针会优先富集具有负静电表面的蛋白质或嵌入膜中的蛋白质。

    因此,烷基二氮丙啶嵌入感兴趣的探针分子时只需改变探针分子的总净电荷,即可调整探针的设计以增强或减少蛋白质捕获:带有净正电荷的探针可以捕获蛋白质组中更多的瞬态相互作用。


本文作者:HYC

责任编辑:ZWY

原文链接:https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.1c02509

原文引用:https://doi.org/10.1021/jacs.1c02509


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