分享一篇近期发表在nature biotechnology 上的文章，题目是“Targeted DNA integration in human cells without double-strand breaks using CRISPR-associated transposases”。这篇文章的核心是将 CRISPR 系统和转座酶联合使用，以一种不引入 DNA 双链断裂的机制，实现了将 DNA 片段整合到人类的基因组中的目标。本文的通讯作者 Samuel H. Sternberg 来自于美国哥伦比亚大学。CRISPR-Cas系统通过 RNA 介导的 DNA 核酸内切酶，能够轻易且高效地在不同细胞类型的基因组上实现基因编辑。该系统对于基础研究、农业应用和人类疾病治疗具有极为重要的意义。在哺乳动物中，Cas9 介导的 DNA 双链断裂 (double-strand break, DSB) 主要通过两种方式进行修复，即非同源末端连接 (Non-homologous end joining, NHEJ) 和同源重组修复 (homology-directed repair, HDR)。NHEJ 的修复效率要比 HDR 至少高出一个数量级。尽管目前有一些基于 HDR 的修复策略被开发出来，但是如果引入的修复片段较长，则大大降低了修复效率；且有部分细胞系本身表达 HDR 修复蛋白机器的能力就较弱，这也大大降低了 HDR 修复的可能性。
近年来，越来越多的研究指出基于DSB 的基因组编辑会产生一些意想不到的后果，包括大规模的基因组缺失、染色体的易位和碎裂等等。而下一代基因编辑工具，如不依赖 DSB 的碱基编辑器的开发，引导我们将目光聚焦到编辑的精确性上来，但是这些编辑器仅能够编辑几个到 50 个碱基对，没有办法在基因组中引入长片段。尽管目前有基于丝氨酸整合酶的编辑器被开发出来，但它在工作的过程中会产生复杂的 DNA 中间体，因此会在基因组上引入意想不到的缺失插入。作者们想到转座酶能够实现大片段的DNA 插入，并且不依赖宿主的同源修复系统，但是转座酶系统的特异性（即在基因组中插入的位置）和插入的拷贝数是不确定的。因此，作者想到 CRISPR-Cas 系统可以提供编辑的位置信息，转座酶可以引入大片段，如果将二者联用，那么就可以实现在特定的位置，引入大片段的 DNA而不依赖于 DSB。作者们利用Cas6 切割产生特定的crRNA，随后 Cas7 和 Cas8 与 crRNA 组装（这些 Cas 蛋白都不具有 DNA 切割活性），这样一来就可以在基因组中特定的位置实现锚定。Cas6/7/8 和 crRNA 组装后的复合物叫做 Cascade。随后，另外一个转座酶相关的蛋白 TniQ 能够自发地与 Cascade 相互作用，随后，TniQ 会进一步招募另外三个转座酶相关蛋白 TnsA/B/C 来实现最终的 DNA 片段插入。其中，TnsC 先与 TniQ 互作，接着 TnsC 招募负责切除碱基的 TnsA 蛋白和发挥重组作用的 TnsB 蛋白。如此一来，就实现了外源 DNA 片段的插入，而不引起基因组双链 DNA 断裂。
之前，研究人员利用失活的dCas9 和一些转录激活因子，比如 VP64 或者 VPR 能够激活特定基因的表达。作者们也将他们的 Cascade 系统与这些转录因子融合表达，也能够实现基因的激活。值得注意的是，作者们强调由于他们使用的是 Cas6 系统，因此可以将多个基因的 crRNAs 串联在一起，随后 Cas6 将串联的 crRNAs 进行切割成单个的 crRNA，如此一来，就可以一次性实现多个基因的激活。
实际上，Samuel H. Sternberg实验室在 2019 年首先开发了这套 Cascade-TniQ 系统（Klompe et al., nature, 2019. https://www.nature.com/articles/s41586-019-1323-z），随后在 2020 年他们将该系统应用在了细菌上，实现了基因组上大片段的插入（Vo et al., nature biotechnology, 2020. https://www.nature.com/articles/s41587-020-00745-y）。本文章是他们课题组经过不断地尝试和优化，首次成功实现了在人类基因组上实现大片段的插入。总的来说，本文利用 CRISPR 辅助的转座酶系统，将大片段外源DNA整合到了人类细胞基因组中。
本文作者：Liu ZH
责任编辑：FTY
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41587-023-01748-1
文章引用：10.1038/s41587-023-01748-1
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