RNA的表达水平在其整个生命周期中受到严格的调控，以确保适当的生物功能[1]。影响RNA转录后的因素主要包括与RNA结合蛋白（RBP）的相互作用、细胞核内的位置以及转录后修饰[1]。目前检测这些因素的策略中应用最广泛的是免疫沉淀，即用抗体从细胞裂解液[2]中特异性结合并提取与感兴趣的表位相关的RNA，然后对回收的RNA进行纯化，用于下游分析，如Illumina测序[3-4]。为了研究RNA和染色质之间不同类型的相互作用，目前已经开发了基于免疫沉淀原理的多种研究方法，例如在RNA-蛋白质互作研究方向中，有RNA免疫沉淀（RIP）、紫外交联和免疫沉淀（CLIP）。在RNA-染色质互作研究方向中，基于免疫沉淀原理的方法包括染色质上相互作用RNA的分析，然后进行深度测序（PIRCh-seq）和染色质RIP，再进行高通量测序（ChRIP-seq）[5-6]。在RNA-N6-甲基腺苷（m6A）修饰的方向中，免疫沉淀测定包括甲基化RNA免疫沉淀结合下一代测序（MeRIP-seq）和m6A-RIP-seq[7-8]。然而这些基于免疫沉淀的方法需要较大的样本量和苛刻的交联条件，因此，若能开发一种不依赖交联或免疫沉淀的敏感原位技术来捕获内源性RNA相互作用，能够很大程度地降低实验设计的难度和成本。2022年10月19日，来自美国弗雷德·哈钦森癌症研究中心基础科学部和美国马里兰州切维蔡斯霍华德休斯医学研究所的Kami Ahmad和Steven Henikoff团队在Nature Methods杂志上发表了一篇题为Profiling RNA at chromatin targets in situ by antibody-targeted tagmentation的文章，他们基于课题组先前开发的CUT&Tag技术，开发出了反转录和标记（RT&Tag），即与染色质表位相关的RNA被抗体和刀豆蛋白A-转座酶5融合蛋白（pA-Tn5）靶向，局部逆转录产生RNA/cDNA杂交体，随后被Tn5转座酶标记用于下游测序。他们展示了RT&Tag在果蝇细胞中捕获非编码RNA roX2和剂量补偿复合体以及与沉默组蛋白修饰相关的成熟转录本的效用，表明了RT&Tag可以检测到N6-甲基腺苷修饰的mRNA，还表明了产生甲基化转录本的基因以RNA聚合酶II的广泛启动子暂停为特征。总之，这种原位抗体连接和标记的高效率使RT&Tag特别适合快速低成本地分析染色质相关RNA。靶向剪接及转座酶技术(CUT&Tag)是一种酶系方法，用于分析完整细胞核内染色质蛋白的结合位点。CUT&Tag绕开了免疫沉淀原理，而是使用抗体在原位连接pA-Tn5。带有测序接头的Tn5随机剪切在抗原表位附近的DNA，并给片段化的DNA加上测序接头，以生成Illumina测序文库。为了创建一种类似于靶向剪切及转座酶技术（CUT&Tag）[9]的方法来检测局部RNA，作者利用了Tn5能标记RNA/DNA杂合双链的能力，首先分离细胞核并使细胞核内的目的蛋白或染色质结合特异性一抗，接着添加特异性结合一抗的链霉亲和素偶联二抗，放大信号并使之带有链霉亲和素，然后加入生物素化的oligo（dT）-接头引物和装有另一个接头的pA-Tn5，两者都与二抗结合。加入逆转录酶后，结合位点附近的成熟转录物转化为RNA/DNA杂交体，并被并列的pA-Tn5标记，从而进一步在缓冲液的孵化步骤中同时进行逆转录和标记（图1a）。为了展现RT&Tag的能力，作者主要将RT&Tag用于检测蛋白质复合物中的RNA、染色质结构域中的RNA和RNA修饰（图1b）。
RT&Tag捕获了MSL2和roX2之间的相互作用首先，作者需要证明RT&Tag信号来源于RNA，作者使用抗体靶向雄性果蝇S2细胞系中的RNA相关剂量补偿复合体（图2a），当缺乏反转录酶时，RNA无法反转录成cDNA，也便无法生成RT&Tag DNA测序文库，而具有反转录酶的MSL2 RT&Tag组，其文库DNA的梯状条带主要分布在200碱基对（bp）到1000 bp不等（图2b）。此外，RT&Tag 图谱的reads主要来自外显子（66%），少量内含子（16%）和基因间reads（18%）（图2c），且大多落在基因体的3’端（图2d），这与oligo（dT）-接头融合从RNA的poly-A尾部启动逆转录一致。接下来，作者评估了MSL2 RT&Tag的性能，通过主成分分析可以看到IgG和MSL2文库之间有明显的区分，且重复生成的文库具有一定的变异度（图2e）。作者进一步进行基因差异表达分析，相对于IgG对照，MSL2的靶向转录物共有121个转录物表达量上调，其中roX2的差异倍数最高，且差异最显著，提示其与MSL2直接相互作用（图2f）。同时，利用UCSC基因组浏览器，在roX2基因体上显示了MSL2 RT&Tag信号的富集，其reads分布具有明显的3’端偏向性（图2g），且MSL2 RT&Tag信号在X染色体区域上高度富集（IgG的4倍）（图2h）。由于MSL复合体结合在雄性X染色体上，通过沉积与激活相关的H4K16ac标记来上调基因表达，作者分别在MSL2富集或非富集转录本的转录起始点（TSS）和基因体上比较了MSL2的CUT&Tag信号和H4K16ac的CUT&Tag信号，其中，MSL2富集转录本比非富集转录本检测到更高的MSL2和H4K16ac CUT&Tag信号（图2i）。总的来说，作者利用RT&Tag检测到了果蝇细胞中已知的lncRNA roX2与蛋白质MSL2的相互作用，并捕获了MSL2和其附近转录本之间的相互作用。
图2 RT&Tag捕获了MSL2和roX2之间的相互作用多梳结构域是染色质上被抑制性组蛋白H3K27me3修饰的区域，且哺乳动物的研究表明RNA参与了它们的建立和维持，因此作者利用RT&Tag来评估是否能检测到染色质结构域内的RNA（图3a）。作者采用H3K27me3抗体，通过RT&Tag鉴定出H3K27me3修饰的邻近区域内富集量相对于IgG显著增多的1342个基因，其中CR43334和CR42862的差异性表达最显著（图3b），在这两个基因上也显示了H3K27me3 RT&Tag信号的富集（图3c）。接着，作者对H3K27me3富集的转录本进行分类，发现它们主要是蛋白编码转录本（图3d），而蛋白质编码的转录本的表达水平低于非富集转录本（图3e），表明这些H3K27me3富集转录本对应的基因可能受到H3K27me3组蛋白修饰抑制。与非富集的转录本相比，H3K27me3 RT&Tag富集转录本在TSS或基因体上同样具有更强的抑制性H3K27me3 CUT&Tag信号，而活化性H3K36me3和H3K4me3 CUT&Tag信号较低（图3f）。Hox基因是多梳结构域的经典抑制基因，该基因群集所包含的基因都显著富集了H3K27me3 CUT&Tag信号。通过热图分析，作者证明了H3K27me3高表达的转录本具有更强的H3K27me3 CUT&Tag信号，而H3K36me3和H3K4me3 CUT&Tag信号较H3K27me3低表达的转录本低（图3h）。上述结果表明，H3K27me3 RT&Tag富集转录本来自多梳结构域内的RNA。
m6A是真核生物中最丰富的mRNA转录后修饰，控制着各种发育、细胞和分子过程，并与RNA代谢的许多方面有关，因此作者希望以IgG为对照，通过RT&Tag获取m6A的特定转录本富集增加或减少的信息（图4a）。首先，作者通过RT&Tag，发现了281个m6A富集转录本和106个m6A减少转录本（图4b），包括已被报道过在m6A中富集的aqz、Syx1A、gish、pum和Prosap转录本，其中，在Syx1A和aqz基因上显示了m6A RT&Tag信号的显著富集（图4c）。接下来，作者对m6A富集转录本和m6A减少转录本进行GO功能注释，发现了m6A富集转录本与发育和转录因子结合GO定义相关，而m6A减少转录本与管家GO定义相关，尤其是翻译过程（图4d）。由于果蝇中METTL3甲基转移酶的同源物与染色质结合并催化新生转录本的m6A修饰，作者进行了METTL3与m6A关系的验证，并检测到m6A富集转录本的TSS处具有高水平的METTL3 CUT&Tag信号（图4e），然后，作者进行了反向验证，使用RNAi将编码METTL3的基因水平降低了80%，从而导致81%的m6A富集转录本的减少。这些结果均表明，由RT&Tag鉴定的m6A富集转录本是METTL3甲基化依赖性的。
图4 RT&Tag捕获富含m6A修饰的转录本
启动子近端RNAPolⅡ暂停在后生动物中是一个广泛的现象，是基因表达调节的一个关键步骤，其对精确控制基因表达是必不可少的。因此，在证明METTL3介导m6A RNA的甲基化后，作者接下来探讨METTL3与m6A是如何影响RNAPolⅡ的暂停和释放状态的。首先，作者检测到表达量前25%基因的转录本在TSS处有METTL3和RNAPolⅡ CUT&Tag信号的富集，还观察到总RNAPolⅡ和METTL3结合呈正相关（图5a），从而推断METTL3必须优先募集到活跃转录位点，这是否意味着高表达转录本是富含甲基化的？然而，m6a富集转录本的表达水平往往低于m6a减少转录本（图5b），且产生m6a富集转录本的基因具有较低水平的活性H3K36me3和H3K4me3 CUT&Tag信号（图5c），因此，m6A甲基化标记与高水平的转录无关。作者发现，果蝇细胞的热休克（HS）可导致METTL3的显著增加，这种增加不仅局限于启动子，还延伸到了Hsp70基因的体内（图5d）。然而，诱导的Hsp70转录物并不积累m6A修饰（图5e），提示METTL3的结合本身并不能可靠地预测甲基化状态。此外，GAGA因子（GAF）是一种结合GAGA基序的DNA结合转录因子，与RNAPolⅡ的启动子近端暂停有关。与GAGA基序富集一致，作者在RT&Tag的m6A富集转录本的TSS处检测到更高的GAF CUT&Tag信号（图5f），可见富含m6A的转录后修饰与高GAF结合的相关性。作者进一步研究总RNAPolⅡ信号在基因体上相对于TSS的分布，并观察到富含m6A的转录物在TSS处具有更高的RNAPolⅡ CUT&Tag信号，而在基因体内则更少（图5g）。接下来，作者计算RNAPolⅡ启动子近端暂停指数（PI），即启动子上RNAPolⅡ信号与基因体上信号的比值，发现与m6a减少的转录本相比，m6a富集转录本的PI水平非常高（图5h）。以上结果表明，在启动子处具有高度聚合酶暂停和高GAF结合的转录本主要富含m6A的转录后修饰。
综上所述，Kami Ahmad和Steven Henikoff团队开发了一种邻近标记工具-RT&Tag，使用抗体来连接Tn5并标记完整细胞核内附近的RNA，从而可以检测内源性的邻近相互作用，其与基于免疫沉淀的方法不同，后者是捕获与细胞裂解物中结合的RNA，然而一些结合在内源条件下可能不会发生。RT&Tag的第二个优势是具有高效率，RT&Tag需要的细胞数量不到100,000个，这比PIRCh-seq和ChRIP-seq至少少到50分之一（表1），这在样本量有限时，比如临床样本或胚胎细胞的样本实验中，这一优势显得尤为重要。RT&Tag的第三个优点是RNA/cDNA杂交可以直接由pA-Tn5用测序接头标记，从而可以利用简单的PCR反应无缝生成Illumina测序库，省掉纯化RNA步骤，使得RT&Tag能够像Auto CUT&Tag一样适用于自动化测序技术。总之，只要有可用的抗体，RT&Tag就可以有许多应用，虽然这项工作只描述了染色质的应用，但RT&Tag不一定局限于染色质，未来的研究可能会将RT&Tag应用于细胞质中的靶标，如RNA-蛋白质相互作用。【参考文献】
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原文出处：
RT&Tag: Khyzha N, Henikoff S, Ahmad K. Profiling RNA at chromatin targets in situ by antibody-targeted tagmentation. Nat Methods. 2022;19(11):1383-92.
CUT&Tag: Kaya-Okur HS, Wu SJ, Codomo CA, Pledger ES, Bryson TD, Henikoff JG, et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 2019;10(1):1930.
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