RNA表达水平在其整个生命周期中受到严格监管，影响RNA转录后的因素包括与RNA结合蛋白（RBP）的相互作用、细胞核内的位置和转录后修饰等，应用最为广泛的测定策略是免疫沉淀，比如用于检测RNA-蛋白质相互作用的RNA免疫沉淀（RIP）和紫外交联和免疫沉淀（CLIP）。染色质特异性免疫沉淀测定包括分析染色质上相互作用的RNA，然后进行深度测序（PIRCh-seq）和染色质RIP，然后进行高通量测序（ChRIP-seq）【1, 2】。N6-甲基腺苷（m6A）修饰RNA的免疫沉淀测定包括甲基化RNA免疫沉淀结合下一代测序（MeRIP-seq），以及m6A-RIP-seq【3, 4】。然而，这些基于免疫沉淀的方法需要大量的样本输入和交联条件的优化，因此需要不依赖交联或免疫沉淀来捕获内源性RNA相互作用的更加灵敏的原位技术。近日，来自美国弗雷德·哈钦森癌症研究中心的Kami Ahmad和Steven Henikoff团队在Nature Methods杂志上发表了一篇题为 Profiling RNA at chromatin targets in situ by antibody-targeted tagmentation 的文章，他们描述了RT&Tag，即与染色质结合的RNA接连被抗体及蛋白A-Tn5转座体靶向，局部逆转录产生RNA/cDNA杂交体，随后被Tn5转座酶标记用于下游测序。他们证明了RT&Tag在果蝇细胞中用于捕获具有剂量补偿复合物的非编码RNA roX2和与沉默组蛋白修饰相关的成熟转录物的效用。RT&Tag可以检测N6-甲基腺苷修饰的mRNA，并表明产生甲基化转录本的基因特征是RNA聚合酶II的广泛启动子暂停 。总之，这种原位抗体连接和标记的高效率使RT&Tag特别适用于染色质相关RNA的快速低成本分析。为了创建一种类似于CUT&Tag的方法来检测局部RNA，作者利用了Tn5能标记RNA/DNA杂合双链的能力，如下图1a展示了RT&Tag的工作流程。简单来说，就是首先分离细胞核并结合特异性一抗，添加与一抗结合的链霉亲和素偶联二抗，随后是生物素化的oligo（dT）-接头引物和装有第二个接头的pA-Tn5，两者都与二抗结合。接下来利用生物素化的oligo（dT）-接头融合通过选择性地启动附近的RNA进行逆转录，逆转录酶将结合位点附近的成熟转录物转化为RNA/DNA杂交体，这些杂交体被并列的pA-Tn5标记，进一步在缓冲液中同时进行RT和标记工作。作为概念验证，他们利用RT&Tag检测到了果蝇细胞中已知的lncRNA roX2与MSL2的相互作用【5】。在验证了RT&Tag的有效性之后，作者继续利用它来识别与染色质结构域相关的RNA。Polycomb域是用抑制性组蛋白H3K27me3标记的染色质区域，用抗体靶向H3K27me3，RT&Tag鉴定了1342个转录物，大多数为编码蛋白质的转录本且表达水平低。此外，与未富集的转录本相比，H3K27me3 RT&Tag富集转录本在TSS处或基因体上方具有更强的抑制性H3K27me3 CUT&Tag信号，而活性H3K36me3和H3K4me3 CUT&Tag信号较低。这些数据表明H3K27me3 RT&Tag富集转录本来自Polycomb结构域内的受抑制基因。图2. RT&Tag捕获polycomb域中的转录本。前面已经证明RT&Tag可以检测蛋白质复合物和染色质结构域中的RNA，那么是否可以用于检测RNA修饰呢？比如丰富的mRNA转录后修饰m6A。作者认为RT&Tag可以提供相对于IgG对照，m6A的特定转录本是增加还是减少的信息，通过RT&Tag，发现了281个m6A富集转录本和106个m6A减少转录本。为了验证这一m6A富集基因列表，作者使用RNAi将编码METTL3的基因水平降低了80%，从而导致81%的富含m6A的转录物减少。总之，这些结果表明，由RT&Tag鉴定的富含m6A的转录本是METTL3甲基化依赖性的。此外，作者还观察到总RNAPolII和METTL3结合呈正相关，进而推断METTL3必须优先募集到活跃转录位点，是否意味着高表达的转录物其实应该是富集甲基化的？但实际上是m6A富集的转录物往往以较低水平表达，因而m6A甲基化标记与高水平的转录无关。GAGA因子（GAF）是一种结合GAGA基序的DNA结合转录因子，与RNA PolII的启动子近端暂停有关。与GAGA基序富集一致，在富含m6A的基因的TSS处检测到更高的GAF CUT&Tag信号。出于这个原因，作者研究了总RNA PolII信号在基因体上相对于TSS的分布，并观察到富含m6A的转录物在TSS处具有更多的RNAPolII信号，而在基因体内则更少，表明在其启动子处具有高度聚合酶暂停和高GAF结合的转录本主要富含 m6A 转录后修饰。总之，他们开发了一种邻近标记工具RT&Tag，使用抗体来连接Tn5并标记完整细胞核内附近的RNA，使得可以检测内源性邻近相互作用，而非捕获与细胞裂解物中结合的RNA。其他优势在于它的高效率，相对于PIRCh-seq和ChRIP-seq所需的细胞数量至少少50倍，当样本输入量受限时（比如胚胎细胞等）更能体现这一点的重要性，以及还可以更加深入地了解m6A修饰。RT&Tag还会有许多应用，虽然这项工作仅描述了染色质的应用，但RT&Tag不一定限于染色质，未来的研究可能会针对细胞质中的靶标调整RT&Tag，例如RNA-蛋白质相互作用。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41592-022-01618-9
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