Nat Methods：活细胞内以CRISPR辅助的定向标记RNA结合蛋白的新技术

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占人类转录组约98% 的非编码RNA曾经因功能未明而被视为细胞中的“暗物质”。近年来长链非编码RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs）的相关研究成为领域内的一个热点。越来越多研究表明，lncRNA可能参与细胞内一系列重要的生理活动，包括转录调控、染色质三维结构调节以及蛋白质的翻译与转运等，并且lncRNA也被发现与肿瘤发生发展也有着密切关系。


RNA结合蛋白（RBP）与lncRNA之间的相互作用决定了RNA分子的功能和命运。因此精准鉴定lncRNA的相互作用蛋白可以帮助我们更好地揭示某些复杂人类疾病的分子机制。近年来，开发鉴定RNA 相互作用蛋白的方法研究也引起越来越多的关注，包括了CHIRP-MS (Chu et al., 2015 Cell) [1], RAP (McHugh et al., 2015 Nature) [2] 和 iDRiP (Minajigi et al., 2015 Science) [3] 等，极大地推动了相关研究的发展。这些方法或是基于蛋白质提取后的RNA测序，或是基于RNA捕获后利用质谱分析RBP。它们的相似度之处是都使用了紫外或者化学交联等辅助手段来固定RNA和RBP的互作复合体，然后以特定的目的蛋白或RNA序列为“钓饵”来捕捉复合体。然而交联在损伤细胞的同时可能引入较强的偏差，例如原本随机或远距离的“旁观者”可能被固定在一起而被捕获，使结果的可重复性降低，并且产生较多假阳性。


近日，香港城市大学的严健教授、张亮教授和陈居明教授带领的联合研究团队（论文共同第一作者包括易文凯、李靖宇、朱孝轩和王曦博士）与西北大学合作，在Nature Methods 发表题为“CRISPR-Assisted Detection of RNA-Protein Interactions in Living Cells”的研究论文，阐述了该团队新开发的一种检测活细胞内RNA与蛋白质相互作用的方法CARPID （全称CRISPR-Assisted RNA-Protein Interaction Detection Method)。该方法基于CRISPR/CasRx系统，将BASU生物素转移酶与没有切割活性的CasRx融合，之后利用特定的guide RNA将融合蛋白牵引至活细胞中目标lncRNA旁，对邻近蛋白进行生物素化标记，以方便使用链霉素亲和偶联磁珠分离标记的蛋白质 (图1)。分离到的蛋白质通过质谱的无标记定量分析，可以确认目标lncRNA的RBP。

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图1. CARPID方法示意图


首先团队将CARPID方法应用于在X染色体表观调节中有核心功能的lncRNA XIST。结果重现了一些已知的XIST 相互作用RBP，如RAD21、SMC1A、ATRX和BRG1等。另外CARPID还新发现了多个之前未曾报道的XIST相互作用RBP，包括转录起始因子TFIID亚基TAF15和ISWI染色质重塑因子SNF2L (图2)。随后的生化和功能验证确认了TAF15以及SNF2L直接与XIST lncRNA相互作用，并参与调控哺乳动物雌性细胞X染色体失活。

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图2. XIST相关蛋白网络


此外，团队还将CARPID应用于另外两个具有不同长度、表达水平和亚细胞定位的lncRNA——DANCR和MALAT1，发现并验证了各自的相互作用RBP。值得注意的是，对比CARPID在同一细胞类型内对XIST、DANCR和MALAT1三种lncRNA富集的RBP，可以发现几乎没有重叠，显示出此方法的强大特异性 (图3)。总体来讲，CARPID是研究各种长度和表达水平在各种亚细胞定位中的lncRNA的得力工具。该方法的优势在于利用了CRISPR/CasRx系统，在活细胞中对“猎物”进行标记，之后通过蛋白组学的富集分析找到相应的RBP，达到“凡鳞不敢吞香饵”的特异性。

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图3. 不同lncRNA的CARPID结果比较


香港城市大学张亮教授团队在应用定量蛋白组学研究信号传导方向有深入的研究。包括开发标记和富集不同蛋白修饰、蛋白-蛋白相互作用、蛋白-核酸相互作用的方法。富集特异蛋白组和非标记定量质谱在阐明生理病理机制和开发疾病标志物等方面有广泛用途。


原文：

https://www.nature.com/articles/s41592-020-0866-0

CRISPR-assisted detection of RNA–protein interactions in living cells

Wenkai Yi, Jingyu Li, Xiaoxuan Zhu, Xi Wang, Ligang Fan, Wenju Sun, Linbu Liao, Jilin Zhang, Xiaoyu Li, Jing Ye, Fulin Chen, Jussi Taipale, Kui Ming Chan, Liang Zhang, Jian Yan

Nat. Methods, 2020, 17, 685-688, DOI: 10.1038/s41592-020-0866-0

参考文献

[1] C. Chu et al., “Systematic discovery of Xist RNA binding proteins,” Cell, 2015, 161, 404-416, DOI: 10.1016/j.cell.2015.03.025
[2] C. A. McHugh et al., “The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3,” Nature, 2015, 521, 232–236, DOI: 10.1038/nature14443
[3] A. Minajigi et al., “A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsionand an RNA-directed chromosome conformation,” Science, 2015, 349, aab2276, DOI:10.1126/science.aab2276


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