推荐一篇发表在JACS上的文章，文章题目为“Avidity-Based Method for the Efficient Generation of Monoubiquitinated Recombinant Proteins”，本文通讯作者为加州大学圣地亚哥分校化学与生物化学系的Lalit Deshmukh，他们课题组主要研究方向是用NMR表征生物大分子的结构，以及蛋白质相分离和蛋白质翻译后修饰。蛋白质泛素化协调几乎所有的真核细胞事件，泛素是通过激活酶（E1）、偶联酶（E2）、连接酶（E3）三种酶的协调酶促反应在蛋白上形成单/多泛素修饰产物，然后泛素的七个赖氨酸残基及其N末端的蛋氨酸被进一步修饰会在蛋白上产生多泛素修饰。其中，单泛素化修饰在蛋白上是最为普遍的，且会参与各种生理过程，但是目前限制底物单泛素化修饰的机制并不清楚。研究人员还发现单泛素化的蛋白质通常在多个单独的位点被修饰。由于获取足够高产量和纯度的单泛素化蛋白十分困难，所以每个位点泛素化频率以及这些修饰对靶蛋白物理化学特性的影响目前尚不清楚。在本文中，作者他们发展了一种方法，可以产生单泛素化重组蛋白质。首先，作为概念验证，作者使用了α突触核蛋白和ALIX，以及UbE1、UbE2D3和NEDD4家族的E3连接酶NEDD4L和WWP2。所有的酶在N端都有一个TEV酶切割的His tag，α突触核蛋白与ALIX则在C端有一个不可切割的His tag（αSynHis1-140和ALIXHis1-868*），泛素则在N端带有twin-strep tag，且可以被TEV酶切掉。NMR结果表明泛素带有tag之后，只对结构产生了微弱的影响。之后将酶、泛素和底物混合在一起，加入ATP和MgCl2孵育，之后使用镍柱进行底物及其泛素化产物的纯化，相比于多单泛素化和多泛素化的蛋白上带有多个twin-strep tag，单泛素化产物可以被生物素较为容易地从beads上竞争下来，从而得到单泛素化的重组蛋白产物。WB和SDS-PAGE实验均证明得到了α突触核蛋白和ALIX单泛素化产物。之后，作者用化学蛋白质组学的方法研究了蛋白上单泛素化的位点及修饰率，他们首先用Ac-GG-NHS与靶蛋白上未修饰的lysine残基反应，然后用蛋白酶消化，再用13C-Ac-GG-NHS标记，这样之前被泛素化修饰的位点就带上了同位素标记，之后进行LC-MS分析，通过比较色谱峰面积，就可以知道蛋白不同位点单泛素化修饰的频率。之后，作者用FRAP和染料结合实验发现了单泛素化对这两种淀粉样蛋白的相分离和原纤化特性的不同的影响，反映了它们分子间相互作用的差异，从而为单泛素化对蛋白质聚集的影响提供了独特的见解。总之，作者发展了一种可以产生单泛素化重组蛋白质的方法，而且用化学蛋白质组学的方法对模型蛋白的单泛素化位点进行了分析。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.3c01943文章引用：DOI：10.1021/jacs.3c01943
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