分享一篇发表在Biochemistry上的文章，文章的题目是An Optimized Enzyme-Nucleobase Pair Enables In Vivo RNA Metabolic Labeling with Improved Cell-Specificity。通讯作者是加州大学尔湾分校的Robert C. Spitale教授。
全转录组分析表明，目前，越来越多调控RNA以细胞类型特异性的方式表达。本文中，作者通过体内表达优化的尿嘧啶磷酸核糖转移酶（UPRT）提高细胞特异性RNA代谢标记。通过测试，作者发现5-乙烯基尿嘧啶（5-vu）能够以高细胞特异性的方式掺入新生RNA。同时，作者通过斑点印迹（dot blot）、qPCR、LC-MS/MS和显微镜分析证明了表达3xUPRT的LM2细胞中乙烯基尿嘧啶的选择性掺入。此外，通过上述方法，作者还分析了转移性人乳腺癌小鼠模型的细胞特异性新生RNA。在先前工作中，作者对弓形虫UPRT（TgUPRT）的活性位点进行了三重突变，该突变体（3xUPRT）能够催化5-vu，生成对应的核苷酸，产生含乙烯基标记的新生RNA（图1a-c），而不会在野生型细胞中产生背景标记，而5-乙炔基尿嘧啶（5-eu）则会在野生型细胞中产生较高的背景标记。随后作者通过CRISPR/Cas9将3xUPRT基因敲入MDA-MB-231 LM2（LM2）细胞，得到(+)-3xUPRT细胞。本论文中，作者用DMSO（阴性对照，5-vu和5-eu的溶剂）、5-乙炔基尿苷（5-euD，阳性对照）、5-乙烯基尿苷（5-vuD，阳性对照）、5-乙炔基尿嘧啶（5-eu）和5-vu分别处理LM2野生型（WT）和(+)-3xUPRT细胞，3 h后，提取并dot blot分析细胞RNA，通过ImageJ对dot blot化学发光信号进行量化，结果显示，相较于5-eu，5-vu处理展现出了更高信噪比，(+)-3xUPRT细胞与WT细胞化学发光信号比值更高（图1d-e）。
接下来，作者通过乳腺脂肪垫将LM2 WT（阴性对照）和(+)-3xUPRT细胞分别植入NSG雌鼠以形成异种移植小鼠，随后用5-eu和5-vu分别处理上述两种小鼠，并将5-euD和5-vuD分别处理的LM2 WT肿瘤小鼠作为阳性对照。处死小鼠后，提取肿瘤和器官RNA，并将其与生物素-四嗪反应，dot blot结果显示，相较于5-eu，5-vu处理展现出了更高信噪比（图2a-b）。为了量化WT和(+)-3xUPRT肿瘤代谢标记转录本的富集，作者在RNA与生物素-四嗪反应后，进行逆转录反应，再将RNA-cDNA杂交体与链霉亲和素磁珠共孵育，通过RNase水解和加热，分离洗脱cDNA，随后通过qPCR定量cDNA。作者对内源波形蛋白（在LM2细胞中高表达）和外源GFP对应的RNA进行了qPCR量化。作者将未进行处理的小鼠RNA作为阴性对照，将5-vuD处理的WT肿瘤作为阳性对照，以未处理小鼠的检测基因富集程度为标准，通过2−dCT法计算富集倍数，结果显示，(+)-3xUPRT/5-vu组可检测到上述两种基因至少10倍富集（图2c）。作者对3周和4周异种移植小鼠的WT和(+)-3xUPRT肿瘤RNA进行了量化，以确定RNA所有尿苷中的含乙烯基取代的尿苷的百分比。由于在4周异种移植小鼠中检测到了明显的肺转移，作者也分析了4周肺RNA。作者选取5-vuD处理小鼠的WT肿瘤和肺RNA作为阳性对照，并以未处理的小鼠组织RNA为标准，结果显示，5-vu占总尿嘧啶残基的0.1%，而细胞中5-vuD RNA标记的掺入率为0.8%，相较而言，动物实验中5-vu的掺入率是非常可观的（图2d）。图2 异种移植小鼠WT和(+)-3xUPRT LM2原发性肿瘤的细胞特异性RNA代谢标记为了实现新生RNA成像，作者用四嗪-Cy5标记小鼠肿瘤和肺组织切片中的新生的、乙烯基标记的RNA。作者将3xUPRT和mCherry蛋白融合，肿瘤切片显示，mCherry均匀表达，表明细胞表达了3xUPRT。4周肺组织切片显示，分散的转移性(+)-3xUPRT LM2细胞mCherry信号与Cy5信号共定位，表明RNA代谢标记是具有细胞特异性的。作者在与四嗪-Cy5反应的WT肿瘤切片或肺组织的周围细胞中并未检测到背景信号。相较于肿瘤组织，肺组织的总体荧光信号强度较弱，这可能是肺距离腹腔注射（IP）部位更远造成的。上述结果表明，在小鼠组织中，只有(+)-3xUPRT细胞可以利用5-vu进行代谢标记新生RNA，表明3xUPRT/5-vu可实现细胞特异性新生RNA体内成像（图3）。图3 肿瘤组织(+)-3xUPRT-mCherry LM2细胞的代谢标记总之，作者通过体内表达优化的UPRT，将5-vu掺入新生RNA，降低了代谢标记背景，提高了代谢标记细胞特异性。随后，作者通过dot blot、qPCR、LC-MS/MS和显微镜分析证明了5-vu特异性掺入，并展示了3xUPRT/5-vu应用于新生RNA细胞特异性体内成像的可行性，为细胞转录途径的研究提供了一种新方法。https://doi.org/10.1021/acs.biochem.2c00559原文引用：10.1021/acs.biochem.2c00559
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