大多数生物地球化学循环通过水溶性代谢物发生，因为它们是有机物分解和微生物代谢的产物。例如，土壤中的大部分氮元素存在于高分子量聚合物（主要是蛋白质）中，这些聚合物解聚成氨基酸和小肽链，易于被微生物和植物吸收。水溶性代谢产物也是微生物合成的产物。例如，解聚释放的氨基酸可以由微生物合成的氨基酸补充。微生物合成可能在其他代谢物类别中占主导地位，例如多胺、季铵化合物和许多非蛋白质氨基酸，它们不是有机物质分解的产物

尽管水溶性代谢物在生物地球化学循环中起着核心作用，但我们对水溶性代谢产物的起源和整个运转周期的认识仍存在很大差距。同位素标记研究表明，微生物生物量碳元素的周转时间为100-150天，但组成微生物生物量碳元素的化合物的周转时间非常不同，因此，100-150天的名义周转率是所有化合物周转时间的平均值。例如，膜脂的周转大约为42-47天，而土壤DNA/RNA标记迅速，同位素示踪物持续存在，表明DNA/RNA在微生物群落水平中循环。化合物之间周转率的一些差异反映了纳入微生物生物量的代谢途径的差异，但有一个重要的组成部分反映了群落级水平循环的程度。大分子的循环程度已经被推断出来，但关于单个水溶性代谢物的周转情况，几乎没有什么信息。

在个体水溶性代谢物水平上的大多数研究都涉及同位素库稀释估计进入和流出土壤溶液的通量，或测量¹³CO₂或¹⁴CO₂的流出以揭示矿化过程。然而，这两种方法都不能提供从头合成的信息。关于合成的信息将有助于我们推断水溶性代谢物的通量这个假设在一定程度上是由从头合成支撑的，而不是由回收的相同分子支撑的。例如，有人假设，对于作为细胞内渗透压细胞发挥作用的代谢物，可能存在强烈的群落级水平循环，但它们的快速通量也可能反映微生物摄取和随后的细胞内代谢（例如矿化和/或转化为其他有机化合物）导致的从头合成和消失。因此，有必要确定水溶性代谢物的从头合成，以便在已知的土壤溶液库快速周转的情况下进行。

用重水（D₂O）进行同位素标记可以提供一种方法来估计水溶性代谢物的合成。更常见的测定合成的方法是通过添加放射性或稳定同位素标记的底物，但这种方法有几个局限性。最大的限制之一是不同的微生物需要不同的基质，许多标记的同位素土壤在商业上无法获得。 因此，D₂O标签的一个优点是，它不需要事先了解基质要求。D₂O的另一个优点是，标记时间可以延长，因为微生物不会受到基于底物的标记通常需要的异常高的底物浓度的影响。D₂O的主要应用之一是脂质稳定同位素探测，其中D₂O作为“通用示踪剂”，在脂质生物合成过程中用²H代替¹H。²H的掺入不限于脂质。例如，D₂O中的2H也会结合到微生物的蛋白质中，并被用作活性微生物代谢的指标，并使用NMR（核磁共振）和拉曼光谱探测发酵过程中的化合物通量。代谢物通过两种主要方式从D₂O标记²H2H（图1）。²H可直接并入直接从水中衍生的氢中，或当D₂O中的²H与随后并入代谢物的底物或电子载体（例如NADH还原型辅酶Ⅰ）的有机部分中的¹H交换时。

原则上，D₂O标记允许在原位条件下跟踪合成，而无需提供额外的能源或实质性地影响底物浓度。D₂O标记已用于确定泥炭和沉积物中脂质的合成，此前有人认为，土壤中非交换性H的同位素组成反映了微生物生物合成过程中D₂O中²H的掺入。然而，D₂O标记尚未用于检测土壤中广泛存在的小范围水溶性代谢物的合成。土壤中的一些水溶性代谢物主要来源于合成，一些来源于坏死物质的分解代谢（例如水解），以及二者结合的其他代谢物（图1）。这些差异在²H合并模式中应该很明显。对于直接结合²H的代谢物，标记累积的初始速率等于反应的通量。对于由两条途径产生的代谢物，一条含有²H，另一条不含有²H，标记和未标记产物的部分趋向于同位素稳态——标记和未标记的库大小反映了通过标记和未标记途径的相对通量。在添加D₂O的土壤中，坏死物质库将是未标记水溶性代谢物的来源，因为聚合物（例如源自坏死物质）的水解不会导致持续的²H掺入。这似乎与直觉相反，因为水解需要添加两个H，但添加到C（羟基中）端的的H和添加到N（氨基）端的H不会被保留，而是在样品制备过程中容易与环境水中未标记的H交换。

本研究的目的是研究D₂O标记的可行性，以检查土壤中小的水溶性代谢物的合成。之前有研究认为，假定渗透压的代谢物的快速循环代表了群落层面的循环，其中相同的分子重复循环，没有明显的合成和细胞内转换。如果群落级循环的假设是正确的，那么这应该表现为渗透质的缓慢²H富集。我们还预测，对于存在大量坏死物质库的代谢物（例如，从微生物细胞壁聚合物中提取的己糖胺和胞壁酸），²H的富集会很慢，因为在合成代谢步骤中摄入的²H只有在循环通过坏死物质后才会以²H代谢物的形式出现。

Fig.2 |  a)湿润土壤和b)以自然同位素丰度(H₂O)或50atom% D₂O或99.9atom% D₂O添加水的干燥土壤的呼吸作用。在加水之前，湿润土壤的重量含水量为10%，干燥土壤的重量含水量为2%，两种土壤都适量加水，使含水量达到田间持水量的85%。在潮湿土壤水的原子百分比估计现在D₂O12.5%(50atom%D₂O)和25%(99.9atom% D₂O添加),而重新润湿湿干燥土壤水的原子百分比作为D₂O43%(5atom%D₂O)和87%(99.9atom% D₂O)补充道。在加水之前立即进行T0测量。数据是三次重复的平均值和标准误差。

一些证据表明，GC-MS和CE-MS能够准确测定同位素的相对丰度和总富集度。在CE-MS和GC-MS中，从未标记样品中测得的代谢物同位素分布与理论分布非常匹配（图3和补充图1），表明质谱法能够准确估计同位素丰度。GC-MS检测的是片段，而不是完整的代谢物，因此，如果标记具有位置特异性，则同位素富集的估计可能会受到片段选择的影响。海藻糖和阿拉伯糖醇的不同片段之间的富集程度呈强正相关（补充图2），这表明标记没有强烈的位置特异性，因此对片段的分析可以得出整个分子同位素富集的准确图片。在通过单一途径同化单一底物的过程中观察到的位置特异性可能不会与D₂O标记一起出现，因为²H是从一系列不同的前体（²H在D₂O中，²H在电子载体和无数不同的底物中）结合而来的。

D₂O被用于标记土壤，因为它大约比H₂¹⁸O便宜100倍，但使用D₂O还有其他优点和缺点。D₂O的一个缺点是，²H标记的代谢物的保留时间（GC-MS）和迁移时间（CE-MS）略短于未标记的同位素组，因此需要为每个同位素组独立测定峰值。相比之下，¹⁸O标记通常对保留时间没有明显影响，因此¹⁸O标记数据的整合很容易实现自动化。H₂¹⁸O标记的一个主要缺点是，它在概念上更为复杂，因为在蛋白质水解过程中引入的¹⁸O分子会被保留。因此，通过H₂¹⁸O标记，水解提供了D₂O不存在的标记途径（图1）。

Fig.1 | 显示D₂O标记代谢物的简化概念图 (a); (b)直接从水、²H -底物或NADH中吸收H的代谢物的²H标记模式; (c)两个途径产生的代谢物，其中一个途径导致²H标记。代谢产物通过合成代谢反应成为²H标记物(在不可交换的位置)，或者通过D₂O直接加入²H，或者使用²H底物或电子载体。一些代谢物随后可能形成复杂聚合物的一部分，而另一些仍然是单体。代谢物在微生物生物量中的停留时间可以通过循环来延长，其中代谢物从微生物生物量流出并随后从溶液中重新捕获。对于某些代谢物，例如那些细胞壁聚合物的成分，在残留物内可以有一个大的缓慢循环的代谢物库。对于直接由示踪剂(b)生成的代谢物，当添加D₂O时，随着时间的推移，代谢物库的一部分会被标记。假定同位素标记不会扰乱代谢稳定状态，因此库的大小保持不变，进出库的通量保持平衡。图(c)显示了两种途径产生的代谢物的情况，其中只有一条途径导致²H的掺入。在短期内，坏死库是未标记代谢物的来源。在同位素稳定状态下，未标记库与标记库的大小显示了来自两种途径的相对通量。