MASEV技术在抗体和荧光染料之间使用生物正交可切割的连接子。该连接子含有C₂对称的TCO部分（C₂TCO），性质稳定，不影响亲和配体的荧光性质。当加入功能化的四嗪剪刀（HK-Tz）时，荧光染料被选择性地从抗体中切割下来，实现快速且干净的脱色。在非常温和的微摩尔浓度下，可以去除>99%的荧光团衍生信号（图1）。90%以上的脱色在1-2 min内完成，然后可以对EV进行后续轮次的染色。作者还开发了专门构建的流动腔，无需苛刻的条件（例如,多聚甲醛固定和粘附EV或过氧化氢漂白荧光染料），以便试剂实现快速循环和保存，从而对单个EV进行明确的分析。该小室使用丙烯酸压敏胶将处理过的盖玻片粘在显微镜载玻片上。压敏胶（宽4 mm,长12 mm,高50 μm）的形状允许在约4 μL通道内以约1 μL/s的流速进行无泵冲洗，疏水性硅烷化处理将其粘附在EV上，并在多次染色过程中防止流通池泄漏或润湿。用Tween-20孵育处理过的玻璃器皿，降低了非特异性抗体粘附，从而使背景相对于普通载玻片（1.8×）、现成的粘合剂包被的聚四氟乙烯载玻片（1.8×）或聚L-赖氨酸包被的载玻片（5.5×）等基底降低了数倍。

图1.MASEV原理图

MASEV表面捕获及样品处理的优化

    作者首先通过测定AlexaFluor350-PEG12-四氟苯酚（TFP350）标记EV在载玻片上的保留率，确定EV的捕获率。将多个细胞系来源的EV粘附在处理过的玻片上，使用一组15个抗体进行5轮MASEV循环。EV的捕获效率由保留在第1轮生成的TFP-EV ROI内的TFP-EV信号决定。数据显示，同一天的实验在5个循环中获得了超过99%的EV（图2A）。如果过程持续2天以上，第2天EV损失5-10 %。因此，作者选择在一天内完成所有实验。

迭代多重标记

    随后，作者研究了单个EV的荧光团添加和去除时芯片上的信号动力学和循环效率。以CD9作为EV标志物，作者对PANC-1细胞系来源的EV进行处理，用3种不同的抗体-C2TCO偶联的荧光染料（MB488、AF555或AF647）测量染色和去染色EV的信号强度（图2B）。染色后的EV在488通道的单EV信背比（S/B）为5.7 ±0.4，脱色后下降至1.1±1.2，平均EV信号与载玻片背景无法区分。同样，对于555和647通道，染色（vs.脱色）S/B分别为7.4±1.8 （vs.1.2±0.4）和6.0±0.4 （vs.1.1±1.1）。这些数值与在其他情况下观察到的>95 %的结果一致。

    接着，作者对EV生物标志物进行了染色和脱色实验（图2C）。作者使用三联体抗体共5轮染色和脱色。数据表明，对于大多数C2TCO抗体标记的EV，在三个荧光通道上的切割效率为99%。品红通道（628/692nm ex/em）背景最低，而红色通道（562/593nm）和绿色通道（472/520nm）背景较高，与AF350通道（387/447nm）相比在1.4-4×之间变化。因此，通过在绿色通道和红色通道中标记的合理分配，可以在背景信号干扰最小的情况下处理15种生物标志物。

    除此之外，作者确定了染色和脱色在5个循环中的可重复性。如图2D所示，以CD9-AF647为原型标记物，在5个周期中，模型丰富的标记物如CD9的染色模式具有显著的可重复性。CD9是一个相对丰富的分子，每个表达的EV有大约20个蛋白拷贝数，所以可以测试连续循环是否会导致类似数量的EV。数据显示，在额外的循环周期中，EV的阳性率从22.5 %到27.6 %不等。对于丰度较低的分子，会出现结合位点可用或在单分子水平上被前一个周期（如果同一目标分子再次成像）掩盖或某个EV区域结合到玻璃表面而抗体无法接触到的随机效应。这样的重复测量对于丰度较低的分子是没有意义的。换言之，这些局限性大多与生物标志物稀缺性而非技术有关。作者指出，在数以千计的EV中平均生物标志物呈阳性。

图2. MASEV方法的表征

EV生物标志物的情况

    群体研究方法（Western , ELISA）经常指出四跨膜蛋白、ALIX、TSG整合素和syntenin蛋白是EV形成所必需的含量丰富的生物标志物。一些其他EV蛋白最近也被发现含量较多，主要是通过对大量EV （ CD47、CD29 （ITGB1））、ATP1A1、SLC1A5、SLC3A2、BSG ）进行质谱分析。目前尚不清楚的是，其中一些假定普遍存在的生物标志物是如何在单个EV上表达的。它们是否在所有EV中都以不同浓度存在？或者是某些EV富集在特定蛋白中?从本工作的数据结果中可以看出，在任何EV群体中个体生物标志物的分布都存在异质性（图3A）。在PANC-1中，丰度最高的生物标志物为CD9（占全部EV的47.9 %）、CD29 （26.0%）、CD47 （19.9 %）、CD63 （12.9 %）、CD98 （11.5 %）、CD81 （7.3 % ）和Alix （6.5 %）。其他标记物均存在于20 %以下的EV中。在其他细胞系来源的EV中也观察到类似的发现，可检测的生物标志物表达存在一定的差异性（图3B）。

图3. 不同细胞系中单个EV的生物标志物分析

EV生物标志物共存分析

    作者随后分析了每个囊泡中不同生物标志物的共存情况。图4显示了三个四跨膜蛋白（CD9、CD81和CD63）在PANC-1和CAPAN-2中的分布情况。24.8 %的PANC-1 EVs和52.6 %的CAPAN-2 EVs没有四跨膜蛋白。在PANC-1、CAPAN-2、ASPC1和A549四种细胞系中，平均39 %的EV没有四跨膜蛋白 （20-52.6 %），39 %的EV只有一个四跨膜蛋白（35.6-5.0%），22 %EV有两个四跨膜蛋白 （9.4-35.6 %），只有5.4 %的EV有三个四跨膜蛋白（2-8.4 %）。

    作者将这一分析扩展到12种生物标志物，并跨越所有EV类型（图4B）。使用TFP₃₅₀作为EV参考染色剂，作者证实PANC - 1 EV最常见的模式是2或3 （38 %）可检测的标志物，4或5个生物标志物（27 %），0或1个EV生物标志物（18 %），其次是6或7个生物标志物（12 %）。在其他三种细胞系中也观察到类似的分布。在整个集合中，只有小部分囊泡显示有8个或同时含有更多的生物标志物：PANC-1：4.22 %；Capan-2：0.26 %；ASPC1：2.75 %；A549：2.00 %。最近发现的普遍存在的EV生物标志物只存在于单个PANC - 1 EV （如syntenin: 5.1 %）中的一小部分。  

图4. 生物标志物共存分析

囊泡中癌基因和肿瘤抑制蛋白的鉴定

    针对人类癌症的生物标志物群和癌症特异性生物标志物（例如KRAS^mut和P53^mut等突变蛋白）已经确认。有研究表明，其中一些生物标志物存在于EV中。因此，为了将EV诊断用于早期癌症检测，人们希望丰富癌症生物标志物阳性EV。目前至少存在3个挑战：（1）将EV与其他循环囊泡分离；（2）将肿瘤EV与宿主细胞EV分离；（3）鉴定EV表面蛋白，以富集肿瘤蛋白阳性EV。为了便于分析，作者对RAS阳性的A549、LS180和PANC-1细胞系来源的单个EV进行了KRAS^G12D、KRAS^G12S和KRAS^G12V图谱分析，并探索常见的四跨膜蛋白在癌基因阳性的囊泡中的位置。

    图5总结了KRAS^mut数据。作者发现KRAS^G12D在45 %的PANC-1 EV、40 %的ASPC1 EV和20 %的LS180 EV中被检测到。30 %的A549 EV可检测到KRAS^G12S，15 %的CAPAN-2 EV可检测到KRASG12V。相反，在A431等KRAS野生型EV中未检测到突变的KRAS EV。作者还研究了如果使用一个或全部四跨膜蛋白标记进行亲和纯化，会漏检多少个KRAS^mut阳性EV。实验结果显示有显著的EV丢失率，高达80 %的癌基因阳性EV被常规使用的CD63亲和纯化所遗漏。这种低效率将影响临床样本和早期癌症的检出，其中KRAS^mut阳性占所有EV的< 0.1 %。虽然pan-tetraspanin捕获策略可以提高检测率，但他们的结果表明仍会漏检35-45 %的KRAS^mut阳性EV。

图5. 携带肿瘤特异性KRAS突变蛋白的EV分析

绘制EV图谱

    在建立了EV的循环分子分析之后，作者接下来开始绘制不同EV类型的EV图谱。图6A显示了12个生物标志物分析的12000个单EV的代表性图谱。为了确定扩展多路复用是否可以解决不同类型的EV，作者将来自四个细胞系来源的单EV的数据作为确定来源组织的先导测试，并使用t-SNE分析进行降维。结果表明，完全的生物标志物复用可以清晰地分离来自不同细胞来源的EVs （图6B），而有限的生物标志物图谱，如这里描述的CD9、CD47和EGFR三联体，不可以明确分离。这些结果表明，高多路复用方法能够基于常规光谱分辨3/ 4色成像无法区分的分子特征来解析不同的EV类型。

图6. 单EV图谱