分享的文献发表在Nucleic Acids Research上，标题为RNA marker modifications reveal the necessity for rigorous preparation protocols to avoid artifacts in epitranscriptomic analysis，通讯作者是来自德国美因茨大学制药和生物医学科学研究所的Mark Helm和Kristina Friedland教授。真核生物RNA修饰的研究已进入全系统阶段，关于小RNA（<40nt）修饰的研究越来越多，然而小RNA修饰分析会受到tRNA和rRNA降解的影响。在本文中，作者通过检测rRNA和tRNA的特征修饰来跟踪死亡后不同时间点小鼠组织中RNA降解的情况。首先，作者寻找可用于评估不同大小RNA降解状态的特征修饰。结果表明，最具代表性的修饰是m6,6A，因为其几乎只存在于小核糖体亚基18S rRNA中；而m3U作为对应物，是大亚基28S rRNA的典型产物。核糖甲基化Nm（Um，Cm，Gm，Am）以高频率存在于rRNA中，但大多数也存在于tRNA中。作者认为，tRNA和mRNA上Am的信号可能是来自任何一个亚基rRNA，因此他将Am作为rRNA的潜在通用标记（图1）。同时，mRNA上修饰含量均较低，无法作为mRNA特征修饰。接着，作者通过特征修饰的重新分布监测体外RNA降解情况。作者从新鲜的小鼠肝脏中提取Total RNA，并利用RNase诱导其在体外发生降解（图2A-D），最后切胶回收进行定量分析。结果表明，tRNA片段大小的RNA上m6,6A和Am的含量随着时间的推移增加，其余修饰的含量则降低（图2E）。同时，tRNA上m6,6A和Am在分级聚类中聚在一起，且主成分分析（PCA）显示它们与其他修饰分开（图2F），作者认为可能是因为它们包含在相似大小的rRNA片段中，经历相似的降解事件。不过，较小的RNA片段（RF）没有遵循明确的模式，可能是m6,6A和Am以相似大小和代谢稳定性的片段进入tRNA部分，而这些特性会在进一步降解时发散。总之，渐进降解导致两个相反的趋势，即tRNA部分中rRNA修饰的富集，以及在同一部分中tRNA修饰的稀释，后者同时在RF部分中变得富集。
图2 体外降解小鼠肝脏中的Total RNA
随后，作者考察了小鼠死后脑和肝脏RNA降解的情况。在小鼠死后0、1、8和24小时切除小鼠大脑和肝脏（图3A），分离RNA并分析其降解情况（图3B-C），以及tRNA片段中m6,6A的含量（图3D）。作者还测试了两种不同的分离程序，以衡量快速冻结和解冻对降解的影响。结果显示，解冻过程显著促进了肝脏RNA的降解，同时，RNA降解具有组织特异性，肝脏中的RNA比脑中的更容易降解（图4）。
图3 小鼠死亡后肝脏和脑中Total RNA降解情况
图4 体内降解后tRNA和RF的修饰谱比较
最后，作者研究了能否通过RNA修饰图谱对组织进行区分。作者从海马、小脑和皮层分离出RNA，并对其修饰图谱进行了分析（图5）。结果显示，聚类分析和3D PCA分析均表明tRNA修饰图谱可以区分这三种组织。
图5 不同小鼠脑组织RNA修饰图谱比较
综上所述， tRNA中m6,6A与Am含量的比值可用于衡量样品整体降解状态，同时RNA降解具有组织特异性，不同组织应具有不同分离程序。
https://academic.oup.com/nar/article/50/8/4201/6446534#352431646F. Richter, J. E. Plehn, L. Bessler, J. Hertler, M. Jorg, C. Cirzi, F. Tuorto, K. Friedland*, M. Helm*. RNA marker modifications reveal the necessity for rigorous preparation protocols to avoid artifacts in epitranscriptomic analysis, Nucleic Acids Res, 2022, 50:4201-4215.
目前评论：