多肽标记和修饰

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 目前多肽合成定制中,多肽标记及多肽修饰的内容非常多,常用的有N 端标记或修饰、N 端荧光素修饰、光敏剂修饰、N 端脂肪酸修饰、C 端标记或修饰、磷酸化标记、二硫键成环环化、赖氨酸修饰、高氨基酸修饰、PEG修饰、单标、双标、叠氮修饰、Mal修饰、N-Me修饰、偶联等。广泛应用在多肽合成药物、多肽生物学、多肽抗体以及多肽合成试剂的研究中。目前应用广泛的有:非放射性核素标记(C13,H2,N15),荧光标记(FAM,FITC等),生物素标记,磷酸化修饰等。

1. 多肽非放射性核素标记
        目前在多肽非放射性核素标记中,使用广泛的仍然是C13,H2,因为其使用安全,放射性小。现在有比较完全的非放射性标记的氨基酸,可以按照正常的多肽合成方法将标记好的氨基酸直接连接到多肽上。

2. 多肽荧光标记

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        多肽荧光标记由于没有放射性,实验操作简单。因此,目前在生物学研究中多肽荧光标记应用非常广泛,多肽荧光标记方法与荧光试剂的结构有关系,对于有游离羧基的采用的方法与接多肽反应相同,也采用HBTU/HOBt/DIEA方法连接。在N端标记FITC的多肽需经历环化作用来形成荧光素,通常会伴有最后一个氨基酸的去除,但当有一个间隔器如氨基己酸,或者是通过非酸性环境将目的多肽从树脂上切下来时,这种情况可避免在切割的过程中被TFA切割掉。

3. 多肽生物素标记
        生物素-亲合素系统 (biotin-avidin system,BAS),是70年代后期应用于免疫学,并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应,并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合,使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。主要有用于标记多肽氨基的生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)和生物素对硝基酚酯(pBNP),其中以BNHS最常用,当然,也可以直接使用生物素也可以标记,因为其结构上有个游离的羧基,采用HBTU/HOBt/DIEA方法缩合,由于生物素的溶解度低,使用DMSO/DMF的混合溶剂增加溶解度。

4. 磷酸肽多肽合成
        磷酸肽在生命过程中发挥重要作用,磷酸化的位置在多肽上的Ser,Thr,Tyr。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸,目前使用的都是单苄基磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的连接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法,但是目前采用该方法合成磷酸化多肽也有缺点,特别是在合成多磷酸化多肽或氨基酸较长的多肽的时候,连接效率低,最后产品纯度很低,对于这种磷酸化多肽,我们考虑采用后磷酸化方法,其合成过程就是在多肽合成结束后,选择性脱去要标记的氨基酸的侧链保护基,对于Tyr,Thr可以直接使用侧链不保护的氨基酸进行反应,而Ser可以采用Fmoc-Ser(trt),在1% TFA/DCM条件下可以定量的脱除。后磷酸化,采用双苄基亚磷酰胺,四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体,连接到羟基上,随后在过氧酸下氧化生成磷酰基,完成反应。

来源:多肽合成定制


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