日期：2020年8月17日 

杂志：Nature Protocol 
杂志影响因子：10.419 
原文标题：Chromatin integration labeling for mapping DNA-binding proteins and modifications with low input 
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41596-020-0375-8 
来源：日本 东京工业大学

摘要

细胞的身份是通过转录因子结合和基因组上的表观遗传修饰，通过选择性激活或沉默特定基因来确定的。染色质免疫沉淀（ChIP）已成为标绘转录因子结合和组蛋白修饰位点的标准技术。近来，已经开发出ChIP的替代方法来解决对低input表观基因组分析的日益增长的需求。染色质整合标记（ChIL）后测序（ChIL-seq）已被证明对低input样本甚至单细胞的表观基因组学分析的应用，因为该技术可在细胞裂解之前扩增目标基因组序列。用寡核苷酸偶联的抗体（ChIL探针）标记目标蛋白或原位修饰后，通过Tn5转座酶介导的转座，然后T7 RNA聚合酶介导的转录，扩增附近的基因组序列。 ChIL-seq可以在荧光显微镜下和基因组水平上检测抗体靶标的定位。本文描述了ChIL-seq的详细protocol，并提供了关键步骤的评估方法，包括ChIL探针反应，转座，原位转录和测序文库制备。该实验方法通常需要3天的时间来准备测序文库，包括过夜incubation，ChIL探针反应和原位转录。 ChIL探针可以单独制备并保存数月，其制备和评估方案也有详细记录。还介绍了针对多个目标（多目标ChIL-seq）的可选分析。该方法将使ChIL技术可更广泛地用于分析珍贵样品并促进进一步的应用。

内容

基因表达涉及多层调节，包括转录因子与DNA元素的结合，组蛋白修饰和变体交换，三维基因组组织以及染色质与核域的相互作用。转录因子的基因组定位和组蛋白修饰可以是给定细胞类型中转录和表观基因组状态的标志。

参与转录激活和抑制的组蛋白修饰显示特征性定位为可遗传标记。染色质免疫沉淀后再测序（ChIP-seq）显示，在转录活跃基因的转录起始位点（TSS）处富含组蛋白H3赖氨酸4三甲基化（H3K4me3），在活性基因和增强子的两个TSS处均富含H3赖氨酸27乙酰化（H3K27ac）以及非活性基因上的H3赖氨酸27三甲基化（H3K27me3）。尽管ChIP-seq通常需要数百万个细胞，但由于只有有限数量的细胞可用，然而的分析来探索表观基因组变化在发育，分化，衰老和发病机理中的调控机制往往能够得到有限的细胞。表观基因组分析技术的最新进展使得仅使用几百到几千个细胞甚至单个细胞的低输入检测成为可能。

染色质整合标记测序（ChIL-seq）是一种基于免疫荧光的技术，使用了独特的ChIL探针，该探针是抗体偶联双链寡核苷酸（ChIL-DNA），带有T7 RNA聚合酶启动子和Tn5转座酶结合序列（图1和2a）。

用第一抗体和第二抗体ChIL探针对固定细胞染色后，ChIL-DNA通过Tn5转座酶介导的转座整合到附近的基因组DNA中，而ChIL-DNA侧翼的基因组序列通过T7 RNA聚合酶被扩增为RNA介导的原位转录（图1）。ChIL-seq中RNA介导的线性扩增特别适用于低投入分析，可在单个细胞中分析组蛋白修饰。ChIL-seq使我们能够在获得表观基因组概况之前可视化目标蛋白或染色质修饰的空间分布。

图1 
ChIL-seq strategy