Angew. Chem. Int. Ed.｜一种通过修饰赖氨酸的方式实现蛋白质定点标记的方法

  • 128
  • A+

蛋白质的功能多样性及其对一些重要生物学过程的影响激励着天然蛋白质工程的发展。在过去的几十年里，蛋白质选择性标记可以通过生物物理探针、细胞毒素和成像探针来得以实现。在这里，非自然插入、酶法、工程化半胱氨酸等都是了不起的方法，但它们难以适用于精确标记自然界中待探索的大量天然蛋白。此外，基于蛋白质疗法技术的快速进步，对于选择性标记技术的需求也在升级。在这里，VishalRai教授带领的团队展示了一种定向修饰（LDMK-K）技术，这将用于蛋白质中赖氨酸残基的单点标记。


该方法的成功来源于FK1-spacer-FK2试剂衍生的一系列转化（Fig. 1）。首先，官能团FK1与所有可接近的赖氨酸残基进行快速且可逆的化学选择性反应，并调节了FK2在近端赖氨酸残基附近的微量浓度。最后，FK2和赖氨酸的分子内不可逆反应控制了位点选择性，而spacer的设计用以调节偶联位点。


1

Figure 1. Hypothesis and key challenges inthe LDMK-K technology for single-site labeling of a Lys residue.

 

基于作者先前的发现，他首先确定了化合物FK1（Fig. 2）。另一方面，作者希望FK2能够在不可逆反应中为赖氨酸提供比较高的化学选择性。其次，与FK1相比，它应该表现出相当慢的分子间反应。于是作者决定使用带酰化基团的化合物作为待定的FK2，因为它对胺具有化学选择性，并能产生稳定的C-N键。从这个角度来看，作者确定了2a-2f这六个化合物来实现离去基团的能力（Fig.2a）。


核糖核酸酶A（1a）与2a快速反应，并在24小时内生成具有6-11个标签的产品，这明显不符合作者期待的结果，于是作者排除了2a进行进一步筛选的可能性。此外，试剂2b、2c和2d在24小时内生成的产物并不具有单一性，而只有2e和2f产生了单一产物。但与2e相比，2f溶解性更好，因此作者选择2f作为FK2。


2

Figure 2. a)Identification of FK2. % Conversions are estimated byESI-MS
b) LDMK-K reagentdesign (4a-4f, 3-7 step synthesis).
 

在确定了FK1和FK2后，作者合成了具有不同spacer的LDMK-K试剂4a-4f（Fig. 2b），然后将蛋白质核糖核酸酶A（1a）与LDMK-K试剂4a结合。作者兴奋地观察到了在16h内形成了单标记的核糖核酸酶A（6a）（Fig. 4）这一现象。6a的酶切和肽谱证实了这一结果，MS-MS测序证实了K7的位点选择性修饰（Fig. 3）。此外，与4a结合后，核糖核酸酶A的结构和酶活性并未发生改变，这突出了该方案的温和性。


6

Figure 3.  MS-MS spectrum of labeled KETAAAKF (K1-F8, m/z1086.6 [M+H]+) after the digestion of 6a with α-chymotrypsin.


受到了这些结果的鼓舞，作者又相继用胰岛素1b、含有适量伯胺的抑肽酶1c以及泛素1d挑战了这一方法。其中LDMK-K试剂4b在单标记实验中相对而言转化率最高，对1b-1d的转化率分别高达48%、86%和35%（Fig.4）。


7

Figure 4. LDMK-Kenables single-site labeling of proteins. ESI-MS estimates the overall %conversion for two steps.


在成功证明LDMK-K试剂适用于具有中等数量的伯胺的蛋白质后，作者选择了具有较高数量伯胺（13-20个）的α-乳清蛋白、细胞色素C和肌红蛋白。结果表明，α-乳清蛋白能够被LDMK-K试剂4a成功转化为单标记产物6e，而细胞色素C能够同时被LDMK-K试剂4b和4d催化产生单一标记的产物6f和6g。最后，作者选择了含有更多伯胺的肌红蛋白1g。结果表明，肌红蛋白1g能够在42号位赖氨酸被4b标记上，产生单标记产物6h（Fig.4）。


在确定LDMK-K在蛋白质单位点标记中的有效性后，作者利用FK1的多功能性建立了一种高效的固定化和纯化方案（Fig.5）。首先，使用LDMK-K试剂4a进行单点标记后，形成了产物7和8（步骤1）。将产物7和8与未反应的核糖核酸酶A(1a)与酰肼活化树脂(11)在蛋白质纯化柱(步骤2)中混合。未反应的核糖核酸酶A(1a)被回收，产物8通过K7选择性地固定在树脂上，吸附效率很高（>95%）。随后，将树脂分布在四个管中，用于与O-羟胺（5）及其衍生物9a-c的转肟化(步骤3)。经过这些步骤以后，树脂被循环使用，离心可得带有羟胺（6a）和三种不同探针（10a-10c）的被标记上的核糖核酸酶A。


8

Figure 5. Label-tag-purifyprotocol for rendering analytically pure single-site tagged protein with probeof interest.


精确的抗体偶联法对于治疗和诊断是必不可少的。因此作者应用了LDMK-K技术，得到了被荧光团9c标记上的曲妥珠单抗。聚丙烯酰胺凝胶电泳中出现了清晰的荧光带，说明曲妥珠单抗能够成功被荧光团9c标记上。于是作者将9c替换成了抗乳腺癌药物emtansine（9e），形成了ADC（15）。进一步实验证实了15对SKBR-3乳腺癌细胞在2 nM浓度下的生长抑制率为45%，而Kadcyla（16）的抑制率为38%（Fig.6）。


9

Figure 6. a)Labeling of trastuzumab; b) Inhibition of cell proliferation by 17, 16or 15 and 13 (trastuzumab); c) Inhibition of cell proliferationby 17, 16 and 15 (2 nM) in HER-2 positive SKBR-3 ascompared to HER-2 negative MDA-MB-231 cells.


综上所述，作者展示了一种定向修饰（LDMK-K）技术，可用于蛋白质中赖氨酸残基的单点标记。在这一过程中，LDMK-K试剂有效地调节了化学选择性和位点选择性。它为标记蛋白质表面的几个结构域打开了大门。此外，它使NMR标签、亲和标签和荧光团的精确引入成为可能。并且LDMK-K能够合成对HER-2阳性的SKBR-3乳腺癌细胞表现出高度特异的抗增殖活性的药物ADC。


整理：MaJQ

文章题目：

Chemoselectiveand Site-Selective Lysine-Directed Lysine Modification Enables Single-SiteLabeling of Native Proteins

文章链接：

https://doi.org/10.1002/anie.202000062


weinxin
我的微信
关注我了解更多内容

发表评论

目前评论：