分享一篇发表在PNAS上的文章，题目为“A genetically encoded photoproximity labeling approach for mapping protein territories”，文章的通讯作者是普林斯顿大学化学系的Tom W. Muir教授，他的课题组致力于运用有机化学和物理化学的策略来解析蛋白质功能。
蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）在调节细胞功能中起着关键作用。光催化邻近标记（PPL）方法μMap作为检测和表征活细胞PPIs的有效手段，依赖于将光催化剂传递到特定的细胞位点，在光照下局部激活邻近标记（PL）探针，从而标记邻近蛋白。然而，μMap要求光催化剂能够渗透细胞膜，限制了部分以肽或蛋白质为基础的传递方式在活细胞的应用，同时外源加入光催化剂可能存在脱靶，增加PL的背景。因此，作者设想构建i）完全由基因编码；ii）可见光触发的PPL系统。
在挑选基因编码PPL的candidate时，作者关注到黄素单核苷酸（FMN）结合蛋白家族的光氧电压（LOV）结构域。FMN在蓝光下通过单电子转移（SET）激发成三线态，工程的LOV结构域使FMN三线态的寿命比自由辅因子长30倍。于是，作者将一系列工程LOV结构域与组蛋白H2B融合并在HEK293T中表达，用生物素-苯酚（BP）探针标记，蓝光照射激发。结果显示，拟南芥向光素LOV结构域（LOV*）融合后产生了robust的生物素化，1 s即可检测到蛋白标记，短脉冲照射无明显细胞毒性，这种基于LOV*的PPL方法（LITag）具有优异的时空精度。接着，作者探究了LITag用于细胞成像和邻近标记的潜力，发现LITag能和多种细胞兼容，还能融合适当的蛋白质在不同的细胞器内和细胞表面进行。分子机制的研究揭示LITag通过SET标记Tyrosine或以单线态氧介导的方式标记Histidine。
随后，作者将线粒体靶向序列（MTS）融合至HEK293T，结合SILAC定量蛋白质组学技术，测试了LITag系统在线粒体中的保真度。令人满意的是，富集的已知蛋白质全部定位于线粒体。进一步，作者在U2OS中将LOV*融合至PARP1，通过H2O2诱导损伤，识别到的99个targets大多数是PAR binder、PARylation targets或两者兼有，表明LITag可用于在动态细胞过程（如DNA损伤反应）中捕获邻近蛋白。
在证明LITag用于PPL分析的可行性后，作者应用该策略表征主要穹窿蛋白（MVP）的相互作用组，以此来填补MVP分子机制的空白。经过条件的筛选和优化，作者将LOV*融合到人类MVP的N端并在HeLa中表达，用生物素-苯酚（BA）探针孵育，LITag-SILAC表明MVP与核运输和调节蛋白质折叠等功能有关。
综上，本文通过将LOV*与靶蛋白融合开发了一种基因编码的光催化邻近标记方法LITag，可结合定量蛋白质组学绘制高时空分辨率的区域蛋白质图谱。
全文链接：https://www.pnas.org/doi/epdf/10.1073/pnas.2219339120原文引用：https://doi.org/10.1073/pnas.2219339120
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