分享一篇发表在Analytical Chemistry的文章，题目是Multiplexed CuAACSuzuki-Miyaura Labeling for Tandem Activity Based Chemoproteomic Profiling,DOI: 10.1021/acs.analchem.0c04726 。本文通讯作者是UCLA的Keriann M. Backus教授，她的研究主要在化学生物学领域，将化学探针合成与基于活性的蛋白质谱和化学蛋白质组学相结合，以开发化学工具来操纵人类的免疫系统。

随着新型探针的不断发现，基于化学蛋白质组学的方法可以实现不同氨基酸活性位点的分析，发现多功能的蛋白靶标。目前，化学蛋白组学的研究仍然大多数依赖CuAAC，缺乏在功能上与CuAAC相同或互补的生物正交化学反应用于化学蛋白质组学，阻碍了能够同时测定多个氨基酸侧链的多重化学平台的发展。在本文中，作者通过观察钯催化的交叉偶联和CuAAC反应的正交性，报道了CuAAC 和铃木反应双重标记的化学蛋白质组学（称为mCSCP），能够同时评估半胱氨酸和赖氨酸残基标记的新型平台。

作者首先在细胞裂解液中验证了Suzuki-Miyaura（铃木-宫浦偶联反应）能够温和的条件下高效进行，从而具有出色的生物正交性。接下来作者优化了反应的温度、反应浓度、化学计量比、反应时间、生物素-硼酸的结构等多种条件。最后，作者将Suzuki-Miyaura应用于基于活性的化学蛋白质组学。使用半胱氨酸反应性碘代苯基探针，证明了单个碘原子可作为化学蛋白质组学的生物正交富集手柄，与含炔烃的探针相比，对蛋白质和多肽的鉴定数量方面表现出出色性能。此外，作者还发现使用羧基磁珠的单锅固相增强样品制备（SP3）远远胜过标准氯仿/甲醇（CHCl₃/ MeOH）沉淀（图1）。

图1. CuAAC和Suzuki-Miyaura对蛋白质和多肽的鉴定比较。

作者比较了结构相似的碘探针10和炔探针11（图2），发现Suzuki-Miyaura平台可轻松识别蛋白质靶标和亲电探针的标记位点。令人惊讶的是，碘探针10也鉴定了几乎所有由炔探针11鉴定的蛋白质和半胱氨酸。有趣的是，对于细胞内标记研究，发现碘探针10还标记了炔探针11未捕获的大量蛋白质和肽段。

图2. 碘探针10和炔探针11的结构式。

为了确定CuAAC 和Suzuki−Miyaura对同一样品的多重标记是否可行，作者用半胱氨酸和赖氨酸反应性探针依次标记细胞裂解物，用生物素化捕获试剂标记，进行后续的化学蛋白质组学分析。通过三次重复实验，共检测到3930个半胱氨酸标记肽段和7704个赖氨酸标记肽段（图3），只有一小部分肽段(总共62个) 在同一肽段序列中被两个探针同时标记，并且在X射线晶体结构的距离也非常接近。

图3. 通过结合Suzuki-Miyaura和CuAAC对半胱氨酸和赖氨酸进行双重标记。

接下来，作者合成了许多具有双反应活性基团和单活性基团小分子的化合物。基于上述建立的方法并且结合竞争性ABPP原理对化合物文库进行了筛选。其中比较有趣的一点是， 作者发现赖氨酸位点优先反应的小分子由双反应活性（半胱氨酸反应活性和赖氨酸反应活性）的化合物15−18、20和21标记，而不是由单活性化合物（赖氨酸反应活性）19、22、KB3和KB14标记（图4）。以上结果表明半胱氨酸标记可能是赖氨酸标记的必要条件。

图4. （A）通过多重CuAACSuzuki-Miyaura化学蛋白质组学（mCSCP）分析的双功能半胱氨酸和赖氨酸反应探针的化学结构。 （B）代表性的赖氨酸优先被双功能半胱氨酸和赖氨酸反应的化合物15-18、20和21标记，而不是被单一反应的化合物19、22，KB3和KB14标记。

综上所述，作者将铃木反应和CuAAC反应结合在一起以实现双重标记来应用于化学蛋白质组学的研究，并鉴定了双功能半胱氨酸和赖氨酸反应探针的蛋白质靶标。