大家好，今天给大家分享的文献发表在Analytical Chemistry上，标题为Chemoproteomic Approach toward Probing the Interactomes of Perfluoroalkyl Substances，通讯作者为美国加州大学河滨分校的汪寅生教授。

多氟和全氟烷基化合物（Poly-and perfluoroalkyl substances ，PFASs）是具有氟碳链和可变离子或中性官能团的化合物，具备化学性质稳定、防水、防油和摩擦力较小等理化特性，被广泛应用于工业产品和消费品中。由于其难降解的性质以及潜在的生物蓄积性和毒性，接触PFASs可能会对人类和野生动物造成不利的健康后果。2009年5月我国将全氟辛基磺酸及其盐类和全氟辛基磺酰氟列为持久性有机污染物（Persistent organic pollutant, POP）。目前在环境中检出最多的两种化合物是全氟辛酸(PFOA)和全氟辛烷磺酸(PFOS)。

在本文中，作者基于同位素标记的去硫生物素-全氟辛烷膦酸(Perfluorooctanephosphonic acid，PFOPA)探针和液相色谱-串联质谱（liquid chromatography with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析，开发了一种化学蛋白质组学策略，用于在蛋白质组水平上鉴定PFAS的结合蛋白。通过此策略，作者鉴定出469种可能的PFOPA结合蛋白。进一步使用低（10 μM）和高（100 μM）浓度的稳定同位素标记PFOPA探针进行竞争结合实验，鉴定出128种非冗余肽选择性结合PFOPA。作者还证实了脂肪酸结合蛋白5 (FABP5)可以直接与PFASs相互作用，包括全氟辛酸(PFOA)、全氟辛烷磺酸(PFOS)、全氟己烷磺酸(PFHxS)和全氟丁烷磺酸(PFBS)。

在去硫生物素-PFOPA酰基磷酸探针（图1）中，去硫生物素-PFOPA探针与细胞蛋白质的结合促进了酰基磷酸的羰基碳与位于结合位点附近或结合点上的赖氨酸残基的侧链氨基之间的亲核反应，从而将去硫生物素结合到与PFOPA相互作用的蛋白质上，并使用链霉亲和素树脂实现随后的亲和富集。作者考虑到探针标记的赖氨酸的鉴定也可以帮助定位蛋白质中的PFASs结合点，因此作者在PFOPA和去硫生物素亲和标签之间加入了一个γ-氨基丁酰（GABA）连接物，以减少去硫生物素标签对PFOPA与蛋白质相互作用的影响。此外，GABA连接体可以以轻标记或重标记形式引入（即带有六个氢原子或氘原子），从而实现定量蛋白质组学分析。

图1 同位素标记的亲和探针连接和富集PFOPA结合的蛋白质

作者首先用轻型去硫生物素-PFOPA探针处理全细胞蛋白质裂解物、用胰蛋白酶消化蛋白质混合物、链霉亲和素珠富集去硫生物素标记的肽，并使用LC-MS/MS分析样品。LC-MS/MS数据分析表明，在1 mL溶液中加入1 mg蛋白质裂解物，使用10 μM和100 μM探针可识别653和1286种蛋白质。鸟枪蛋白质组学数据显示FABP家族的FABP5为候选PFAS结合蛋白。FABP5是一种脂质和脂肪酸结合蛋白，基于PFASs和脂肪酸之间的结构相似性，作者推断PFASs可能占据蛋白质的脂肪酸结合口袋。螺旋1、螺旋2和环1构成门户结构域是FABPs配体的入口门(图2a)。用100 μM探针进行标记实验时，所有已鉴定的FABP5肽均位于该结构域附近。对于用探针标记的三个赖氨酸残基，K34和K55面向口袋外，而K61面向口袋内。作者还发现含有K61的肽的MS信号强度比含有K34和K55的胰蛋白酶肽的信号强度高约10倍。当采用低浓度的探针（10 μM）时，只有K61被标记，而不是K34或K55。FABP5的静电电位图显示（图2b），在结合部位或附近有一个明显的结合通道，其中标记的K61位于结合袋的入口处，这一结果支持PFOPA与FABP5的脂肪酸结合口袋相结合。此外，作者还观察到在含有修饰赖氨酸肽的MS/MS检测结果中，有一个由去硫生物素GABA残基产生的特征离子（m/z 282.19）（图3）。通过该离子可以用来确认肽中是否存在去硫生物素修饰。

图2 FABP5的X射线晶体结构及FABP5的表面静电点位图

图3 MS/MS 用于轻和重去硫生物素结合肽的离子 

作者考虑到酰基磷酸酯固有的化学反应性也可能导致去硫生物素对细胞蛋白进行非特异性标记。为了识别特定的PFAS结合蛋白，作者采用高浓度（100 μM）的轻标记探针和低浓度（10 μM）的重标记探针进行了竞争性标记实验 (图4)。在低浓度的探针（10 μM）下，标记优先发生在与探针有特异性结合的蛋白质上，而在高浓度的探针（100 μM）下，特异性和非特异性PFOPA结合的蛋白质都被标记。作者首先通过ESI-MS分析确认轻标记和重标记探针的储备溶液浓度是相同的，进而通过至少一个正向和一个反向标记实验发现了128个独特的肽，代表75个不同的蛋白质，重/轻比例小于3.0。实验结果发现FABP5仍然是这75种蛋白质中的一种，其平均比率为1.64，表明了FABP5与PFOPA的特异性结合。此外，在疾病本体语义（disease ontology semantic）和富集分析的基础上，作者发现一些已被识别的蛋白质与人类疾病高度相关，包括阿尔茨海默氏病。

图4 使用稳定的同位素标记的去硫生物素-PFOPA酰基磷酸酯探针进行全蛋白质组的PFOPA结合蛋白分析流程

通过组学数据FABP5被确定为候选的PFAS结合蛋白，作者进一步研究了该蛋白是否能直接与PFASs结合。作者首先用亲和层析法纯化了重组His标记的FABP5蛋白，用羟烷氧基丙基葡聚糖（VI型）柱对该蛋白进行脱脂，并用快速蛋白液相色谱法（FPLC）进一步纯化该蛋白，采用等温滴定量热法（ITC）来测量重组FABP5和PFASs之间的结合亲和力。ITC结果显示FABP5和PFOPA之间有直接的相互作用，解离常数（Kd）为167±34 μM。之前的研究表明PFAS的生物累积性与它们的烷基链长度呈正相关。因此，作者评估了该蛋白质对三种不同烷基链长度的全氟磺酸衍生物的结合亲和力，即全氟辛烷磺酸（PFOS）、全氟己烷磺酸（PFHxS）和全氟丁烷磺酸（PFBS），其Kd值分别为135±7、188±39和66±13 μM。因此，作者验证了PFASs对FABP5的结合亲和力随着烷基链的长度而增加。

综上所述，作者合成了一种稳定的同位素标记的去硫生物素-PFOPA亲和探针，并证明基于该探针，结合LC-MS/MS分析，可以方便地识别和定量与PFAS的结合蛋白质。此外，由于该方法可以避免蛋白质组代谢标记，作者设想该方法还适用于不容易进行细胞培养中的氨基酸稳定同位素标记（SILAC）的组织样品。

文中作者的三个推测：

（1）鸟枪蛋白质组学数据显示FABP家族的FABP5为候选PFAS结合蛋白，之前的一项研究结果是FABP1被鉴定为候选PFAS结合蛋白。作者猜测造成这一结果的原因是实验所采取的HEK293T细胞中FABP1的低水平表达，由此作者进一步发现在HEK293细胞的mRNA或蛋白质水平上无法检测到FABP1。（思考：如果选择一种既表达FABP1又表达FABP5的细胞，再用同样的方法，是否会有新发现。）

（2）基于PFASs和脂肪酸之间的结构相似性，作者推断PFASs可能占据结合蛋白质的脂肪酸结合口袋。

（3）根据分子功能分析。作者发现，除了FABP5之外，还发现了其他9个脂质结合蛋白，作者推测是由于PFASs和脂质之间的结构相似。

图5 持久性有机污染物

文章编号：5

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.1c03507

原文引用：

Zhang Q, Dong X, Lu J, Song J, Wang Y. (2021) Chemoproteomic Approach toward Probing the Interactomes of Perfluoroalkyl Substances. Anal Chem, 93, 9634-9639.