Anal Chem：基于生物荧光共振能量转移检测表观遗传修饰的荧光素酶融合蛋白的通用设计

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abstract

╱ 摘要 ╱

Analytical Chemistry近日发表了东京工业大学Wataru Yoshida课题组关于一个基于双色生物发光共振能量转移（BRET）的全球DNA甲基化水平感应系统，该系统使用甲基-CPG结合域（MBD）融合的萤火虫荧光素酶（Fluc）和非甲基-CPG结合域（CXXC）融合的Oplophorus荧光素酶（Oluc）。此外，利用羟甲基-CpG和半甲基-CpG结合域融合的Fluc，开发了基于BRET的羟甲基化和半甲基化水平感应系统。这些研究表明，目标表观遗传修饰可以使用目标修饰结合蛋白融合的荧光素酶同时进行定量。在这项研究中，作者专注于SnoopTag（SnT）/SnoopCatcher（SnC）蛋白连接系统，以建立一个通用的融合蛋白构建设计，用于任何组合。

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background

╱ 背景 ╱

肿瘤抑制基因的全局低甲基化和启动子高甲基化是癌症的标志。一些修饰的碱基，如5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶、5-羧基胞嘧啶和N6-甲基腺嘌呤已经被确认。DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶的第五位，其中5-甲基胞嘧啶是研究最好的表观遗传DNA修饰，人类基因组包含大约2800万个CpG，其中60-80%通常都是甲基化。生物发光共振能量转移（BRET）是一种不需要结合/自由分离就能检测目标分子的有力工具。作者先前报道了一个基于BRET的全球DNA甲基化水平传感系统，该系统使用甲基-CpG结合域融合的萤火虫荧光素酶（MBD-Fluc）。MBD-Fluc识别基因组DNA上的甲基-CpG，以激发与基因组DNA结合的DNA嵌入染料BOBO-3。MBD-Fluc与基因组DNA结合的量取决于甲基-CpG的量，因此，全球DNA甲基化水平可以通过BRET信号来定量。通过用其他修饰结合蛋白取代MBD，基于BRET的检测方法可用于量化其他表观遗传修饰。作者利用非甲基-CpG(MLL CXXC)-、半甲基-CpG(Uhrf1 SRA)-，通过构建能激发BOBO-1的CXXC融合荧光素酶（Oluc），建立了MBD-Fluc和CXXC-Oluc同时检测甲基CpG和无甲基CpG的双色BRET方法。这些结果表明，通过构建靶修饰结合蛋白融合荧光素酶可以同时定量多个表观遗传的DNA修饰。


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图1  双色生物发光共振能量转移（BRET）的全球DNA甲基化水平检测系统



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╱ 主要内容 ╱

1. 融合蛋白的建立

为了建立一个简易的融合蛋白结构，将目标修饰结合蛋白与荧光素酶进行任意组合，主要研究蛋白连接系统。SpyTag(SpT)/SpyCatcher(SpC)和SnoopTag(SnT)/SnoopCatcher(SnC)已被开发，标签肽能自发地与相应捕手蛋白形成异肽键，没有任何交叉反应，因此标签/捕手系统已被用于构建功能性融合蛋白，如抗体-酶复合物。在这项研究中，我们利用SnT/SnC蛋白连接系统（其连接物小于SpT/SpC）建立了任意组合的靶向修饰结合蛋白融合荧光素酶的通用设计（图2）。为了建立概念验证，制备了MBD-SnT、CXXC-SnT和SnC-Oluc重组蛋白，并连接构建了MBD-SnT-SnC-Oluc和CXXC-SnT-SnC-Oluc。用MBD-SnT-SnC-Oluc和CXXC-SnT-SnC-Oluc进行BRET分析，以探讨基因组DNA中甲基-CpG和非甲基-CpG是否可以被定量检测。

MBD-SnT和CXXC-SnT能自发地与SnC-Oluc形成异肽键，构成MBD-SnT-SnC-Oluc和CXXC-SnT-SnC-Oluc，并且能与基因组DNA上甲基化和未甲基化的CpG特异性结合，激发BOBO-1 DNA嵌入染料，因此全球DNA甲基化水平可以通过BRET信号量化。

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图2  基于BRET的SnT/SnC蛋白连接系统构建MBD-Oluc和CXXC-Oluc用于全球DNA甲基化水平检测

2. MBD-SnT-SnC-Oluc和CXXC-SnT-SnC-Oluc与甲基化和非甲基化DNA的结合分析

生物素化、甲基化或未甲基化的双链DNA被固定化在链霉亲和素载体上，然后将MBD-SnT-SnC-Oluc、CXXC-SnT-SnC-Oluc和SnC-Oluc加入其中，清洗后，通过为Oluc添加发光衬底来测量发射强度。当SnC-Oluc被加入后，在未甲基化和甲基化的DNA上都能检测到低发射强度，表明SnC-Oluc既不与甲基化的DNA结合，也不与未甲基化的DNA结合（图3）。相比之下，甲基化和未甲基化的DNA分别检测到MBD-SnT-SnC-Oluc和CXXC-SnT-SnC-Oluc的较高发射强度。这些结果表明，MBD-SnT-SnC-Oluc和CXXC-SnT-SnC-Oluc能分别特异性地识别甲基化和非甲基化的DNA。

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图3  MBD-SnT-SnC-Oluc和CXXC-SnT-SnC-Oluc与甲基化和未甲基化DNA的结合分析

3. 使用MBD-SnT-SnC-Oluc和CXXC-SnT-SnC-Oluc进行BRET检测

以前的BRET检测是使用腔肠嘧啶h作为发光底物，产生闪光类型的发光，以诱导Oluc和基因组DNA上的BOBO-1 DNA嵌入染料之间的BRET。相反，通过Oluc产生发光类型的呋喃西林更适合获得稳定的BRET信号。SnC-Oluc与呋喃西林产生的发射峰与腔肠净h的发射峰相同（图4），以及MBD-SnT-SnC-Oluc和CXXC-SnT-SnC-Oluc与BOBO-1的发射光谱被归一化为440 nm的强度，其波长不包含BOBO-1的发射强度，以BOBO-1的最大发射强度485 nm的归一化强度作为BRET信号（图5-6）。因此，本研究采用呋喃西林作为BRET检测的发光底物。

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图4  SnC-Oluc与呋喃西林和乙胺嘧啶的发射光谱比较 (A)原始发射光谱；(B)以440 nm处的强度归一化的发射光谱


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图5  用MBD-SnT-SnC-Oluc对不同浓度未处理的HeLa基因组DNA进行BRET检测


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图6  用CXXC-SnT-SnC-Oluc对不同浓度未处理的HeLa基因组DNA进行BRET检测


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conclusion

╱ 总结 ╱

本研究利用SnT/SnC蛋白连接系统构建了MBD-Oluc和CXXC-Oluc融合蛋白。MBD-SnT-SnC-Oluc和CXXC-SnT-SnC-Oluc的发光激发了基因组DNA上的BOBO-1。MBD-SnT-SnC-Oluc和CXXC-SnT-SnC-Oluc的BRET信号依赖于整体DNA甲基化水平，且BRET信号之间存在显著的负相关。

我们还证明了全球DNA甲基化水平通过BRET实验进行了量化，R2=0.99，R.S.D.<3.5%，与使用MBD-Fluc和CXXC-Fluc直接融合蛋白的BRET试验相一致。这些结果表明，SnT/SnC蛋白连接系统可用于构建基于BRET的任何组合靶向修饰结合的蛋白注入荧光素酶，以检测基因组DNA中的靶向修饰。


原文链接

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.2c05066


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