分享一篇由佐治亚理工学院伍荣护教授在Analytical Chemistry上发表的文章，题为“Combining Selective Enrichment and a Boosting Approach to Globally and Site-Specifically Characterize Protein Co-translational O‑GlcNAcylatione”。在这篇工作中，作者通过脉冲追踪标记和嘌呤霉素治疗实现了对蛋白质共翻译O-GlcNAcylation蛋白的选择性富集，通过结合TMT试剂和长时间（48h）糖类似物标记的增强方法，实现了对低丰度蛋白质共翻译O-GlcNAcylation蛋白的监测。

葡糖酰胺修饰（O-GlcNAcylation）指单个O-连接的N-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）连接到蛋白质的丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr）残基上。它在哺乳动物细胞中起着极其重要的作用，调节信号转导和基因表达。这种修饰可能发生在蛋白质翻译过程中，对蛋白质共翻译O-GlcNAcylation的系统和位点特异性分析可以促进我们对这种重要修饰的理解，但由于葡糖酰胺修饰蛋白丰度非常低，共翻译葡糖酰胺修饰蛋白丰度更低，目前对蛋白质共翻译O-GlcNAcylation蛋白的研究依然面临挑战。

在本文中，作者设计了一种结合选择性富集、增强方法和多重蛋白质组学的综合方法，来全局和位点特异性地表征蛋白质共翻译O-GlcNAcylation。

首先，作者通过脉冲追踪标记和嘌呤霉素治疗将共翻译糖肽与预先存在的糖肽区分开来。通过将嘌呤霉素（Puro）和Ac4GalNAz（见图1）添加到培养基中。其中，Puro被用来终止蛋白质合成，处理产生过早的多肽链，确保新合成的蛋白质不会折叠，并且不会发生翻译后修饰。Ac4GalNAz是含有叠氮化物基团的糖类似物，用于标记新合成的共翻译O-GlcNAcylation肽，然后通过点击化学，与可光裂解的生物素炔反应，便于后续富集。这样，实现了对蛋白质共翻译O-GlcNAcylation蛋白/肽的特异性富集。

随后，SP3样品制备方法确保有效捕获截短的共翻译O-GlcNAcylation肽。考虑到蛋白质共翻译O-GlcNAcylation蛋白的低丰度，作者使用了增强方法，将O-GlcNAcylation蛋白在重培养基中用Ac4GalNAz标记48小时，得到增强样品，其包含翻译后和共翻译的O-GlcNAcylation肽。对应的共转化样品和对照样品，则是将培养基从轻培养基切换到重培养基，并用Ac4GalNAz进一步培养细胞1小时。接着，在混合之前，分别用TMT试剂标记增强、共转化和对照样品，再通过LC−MS/MS对样品进行分级和分析。TMT是一组与肽上胺基反应的化学标记试剂。这些试剂是同位素编码的，具有相同的分子量。在MS1中，来自不同样品的相同糖肽将被同时提取用于测序，在MS2中，不同样品中肽产生的不同质量的报告离子使我们能够准确定量。

图1 共翻译O-GlcNAcylation和增强样品标记的实验工作流程

此增强方法可以显著增强MS1和MS2水平上共翻译糖肽的检测。从MCF7 细胞中，超过180个共翻译的O-GlcNAcylation蛋白被位点特异性鉴定，而未使用增强方法时，未检测到共翻译的O-GlcNAcylation蛋白。通过比较共翻译和总O-GlcNAcylation蛋白之间的功能和分布，作者发现共翻译蛋白具有更高的核分布，并且与转录更相关。二级结构和相邻残基在共翻译位点和总O-GlcNAcylation位点之间也有显著差异。

图2 共翻译O-GlcNAcylation蛋白和其他蛋白质在细胞核（Nuc）和细胞质（Cyto）中的分布具有差异

图3 共翻译和总O-GlcNAcylation位点的二级结构和相邻残基存在差异

总而言之，作者开发了一种系统和位点特异性鉴定蛋白质共翻译O-GlcNAcylation的方法，该方法整合了选择性富集、增强方法和多重蛋白质组学，实现了对低丰度蛋白质共翻译O-GlcNAcylation的检测，有助于促进对O-GlcNAcylation修饰的理解。