大家好，今天给大家分享的文献发表在Analytical Chemistry上，标题为Single-Neuron RNA Modification Analysis by Mass Spectrometry: Characterizing RNA Modification Patterns and Dynamics with Single-Cell Resolution，通讯作者为美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的Jonathan V. Sweedler教授。

RNA转录后修饰越来越多被人们认为是细胞翻译机制中的关键调控层。然而，目前分析RNA修饰的方法主要是针对大量组织样本中的修饰，这可能会使群体平均值掩盖了单个细胞的独特的表观转录组。

在本文中，作者开发了一种方法，即通过质谱进行单神经元RNA修饰分析(SNRMA-MS)，该方法能够检测和定量单细胞中的大量转录后修饰核苷。与常规RNA提取方法相比，SNRMA-MS利用优化的样本制备方法，能够检测加利福尼亚州海兔中枢神经系统单个神经元中的16种RNA修饰。SNRMA-MS利用研磨和基于热的样本制备方案，从加州海兔中枢神经系统的单个已识别神经元中释放足够的RNA，用于下游LC−MS分析。

作者得到以下研究结果：

加州海兔在实验上是一个神经生物学的有利模型，因为它有相对较大的神经元(直径为10-1000μm)，并表现出明确的功能、形态和生物化学特征。利用加州海兔中枢神经系统的这些特点，作者开发了SNRMA-MS，其中识别的神经元被手动分离，并经过小体积(~ 5 μL)样品制备方法，使得许多修饰的核苷可以通过LC-MS/MS检测到(图1A-1E)。同时作者优化了样本制备方法，在细胞裂解后，95°C下加热样本3 min。将检测结果与常规苯酚-氯仿RNA提取程序相比，SNRMA-MS检测到15±1个修饰的核苷且峰面积明显高于传统方法(图1F)。这些结果表明，使用SNRMA-MS可以在单个神经元中可靠地检测到加州海兔CNS中超过半数的已知修饰。

图1 使用SNRMA-MS同时检测单个神经元中的大量RNA修饰

接下来，作者利用SNRMA-MS研究转录后修饰的全神经节的测量是否能够代表同一神经节内的单个神经元。将腹神经节中RNA修饰的相对丰度与从同一神经节中分离出的已鉴定的胆碱能神经元R2进行了比较。使用了相同的样本制备方法，以确保不会因分析工作流程的差异而引入偏差（图2A）。13种RNA修饰的归一化峰面积PCA显示R2神经元与其神经节对应神经元之间存在明显区别（图2B）。为了验证PCA结果，通过SNRMA-MS分析了第二组动物(n = 7)的R2神经元和腹神经节，并对检测到的修饰进行了比较（图2C、D）。结果表明R2神经元在转录后修饰的核苷基础上偏离腹部大神经节。虽然已知单个细胞可表现出不同于群体平均水平的分子表型，但这些结果首次证明了RNA修饰异质性分布于同一组织的细胞中。

图2 根据修饰核苷丰度区分从大量CNS组织中鉴定出的单个R2神经元

接下来作者探讨了功能不同的神经元是否表现出独特的RNA修饰化学。作者比较了四种已鉴定细胞的修饰核苷概况：元脑神经细胞、B2神经元、LPI1和R2，在分离前在各自的神经节（即原位）中培养48 h，随后进行SNRMA-MS。PCA评分图显示，根据神经元的功能特性，神经元之间有明显的分离（图3）。即使在原位培养48 h后，仍维持了基于神经元功能的PCA簇形成，尽管与新分离的细胞相比，RNA修饰状态略有不同。这些结果与培养的和新鲜分离的加州海兔神经元的代谢组学差异相似，培养神经元的修饰核苷谱也比新分离的神经元更相似。这可能是由于与培养的神经元相比，天然神经元微环境促进了细胞间的异质性，可能是通过许多突触输入的神经元网络调节。总体而言，SNRMA-MS显示单个神经元的身份和功能可通过其RNA修饰成分进行区分。

图3 已鉴定神经元的RNA修饰图谱

作者利用单细胞分离方法研究RNA甲基化修饰，首先从加州海兔 CNS中分离胸膜神经节，并在ASW CD3-Met存在下于12°C培养2-6天，最后用SNRMA-MS检测。在前6天，未观察到CD3掺入的明显差异，其中观察到m6A的CD3标记比率显著高于Am(图4A)。检测结果表明甲基化率在培养的LPI1神经元中具有位置特异性。作者进一步研究了R2和LPI1神经元中的CD3-m1A标记，将这些细胞与功能不同的MCC进行了比较。在第4天时间点，三个神经元显示出显著不同的CD3-m1A/m1A比值，其中MCC的掺入率最快，R2最慢(图4B)。在三个确定的神经元中，未观察到细胞内CD3-Met水平的明显差异。以上结果表明，SNRMA-MS与稳定同位素标记联用的另一个优点是可以研究细胞特异性RNA修饰动力学。

图4 通过稳定同位素标记研究单个神经元的RNA修饰动力学

最后，作者对单个神经元中的五种修饰核苷进行定量SNRMA-MS分析。使用标准品生成外部校准曲线，在加州海兔中，大脑神经节可分为两个近似对称的左右半神经节，每个半神经节均含有一个MCC(分别见图5A、LMCC和RMCC)，该MCC在生化、形态和功能上与其对应部分同源。R2和LPI1神经元在功能上也是同源的，但位于不同的神经节中(图5B)。加州海兔CNS的这一特征使作者继续探寻这些对称神经元是否显示出相似的RNA修饰量。作者通过SNRMA-MS分别测量了来自两只和三只动物的新鲜分离的MCC和R2/LPI1神经元对中的五种修饰核苷的量，对称MCC对中所有修饰核苷(Cm除外)的细胞内含量几乎相同(图5C-5D)，相比之下，R2和LPI1神经元对所研究的修饰核苷的总量更高且更具可变性。随后作者使用了细胞体积的椭球估计，计算出MCC和R2/LPI1神经元的m1A、m6A、Am、ψ和Cm细胞内浓度在2-20 μm之间，与MCC相比，R2/LPI1神经元的Am和Cm显著更高(图5E)。在R2/LPI1细胞对中观察到了较高的可变性，这可能是由于测量细胞直径的误差或R2和LPI1之间的实际生物学差异所致。SNRMA-MS的这些结果表明可以对单细胞中多种RNA修饰定量分析，并强调了将功能相似的细胞视为潜在异质性群体的重要性。

图5 单个神经元中RNA修饰的量化

综上所述，作者开发了SNRMA-MS方法，在单细胞内同时定量多种RNA修饰。研究工作揭示了与周围大块组织不同的单个神经元的细胞特异性RNA修饰特征。通过将SNRMA-MS与稳定同位素标记相结合，可以比较RNA甲基化动力学。通过定量SNRMA-MS，进一步了解了单细胞分辨率下神经元的独特RNA修饰。同时，利用单细胞分辨率表征表观转录组标记的能力有望在其他同质细胞群体中提供关于细胞特异性转录后调节信息。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.1c03507

原文引用：

Clark,KD, Rubakhin, SS, Sweedler, JV .Single-Neuron RNA Modification Analysis by Mass Spectrometry: Characterizing RNA Modification Patterns and Dynamics with Single-Cell Resolution.Analytical Chemistry,93, 14537-14544.