聚糖的组成、分支和立体化学以及修饰的差异不同大大增加了其机构复杂性，这给聚糖的结构分析带来了巨大的挑战。目前的方法主要依赖于质谱、色谱和核磁共振方法，但这些方法在异构体分析以及分析时间上有局限性。基于纳米孔的单分子检测技术启发了人们利用纳米孔来识别聚糖。然而聚糖的电荷密度低，限制了聚糖的直接纳米孔检测。中科院大连化学物理研究所的梁鑫淼和卿光焱团队使用聚糖衍生化策略，用野生型气溶素（AeL）纳米孔实现了对芳香基团标记聚糖的传感。此研究在2023年以“Identification of tagged glycans with a protein nanopore”为题发表于《Nature Communications》。

作者通过化学衍生化手段将芳香族类型的标签引入到聚糖中，通过重组野生型气溶素(AeL)纳米孔实现聚糖传感（图1a，b）。首先选择带负电荷的唾液酸聚糖进行纳米孔测试。6 ' -唾液酸乳糖（6SL）加入到纳米孔顺式侧，在+100 mV条件下不能产生可识别的电流信号（图1c）。类似地，3 ' -唾液酸乳糖（3SL）也不能产生电流信号，增加电压或盐浓度也不能产生信号。这些结果表明，AeL不能识别这些小的唾液酸寡糖。鉴于AeL传感区域的高正电荷特性和聚糖分析领域广泛使用的衍生化策略，作者用化学方法将芳香基团与聚糖连接起来，利用阳离子-π相互作用增加聚糖与纳米孔的相互作用。用1-甲氧基苯（MB）标记6SL后，得到的衍生物6SL-MB以终浓度~ 2 μM加入到AeL顺式侧时，可以产生堵塞信号（图1d）。堵塞电流比I_b/I₀与停留时间的散点图如图1e所示。

图1

接下来，作者尝试优化标签分子以进一步增强纳米孔堵塞信号。当标签变为1-甲氧基-4-苯氧基苯（MPB）时， 6SL-MPB在AeL中产生更明显的电流阻塞（图1f），意味着大尺寸的标签分子可以引起更强的阻塞。6SL- MPB的散点图显示了与6SL-MB显著不同的特征分布（PIII）（图1g）。此外，作者还测试了不同芳基标记的聚糖，例如萘（NA）、芘（Py）和四苯基乙烯（TPE）（图1h），带有不同标签的聚糖产生不同的堵塞深度的信号（图1i）。其中MPB所产生的堵塞信号更清晰且易于识别，后续实验采用MPB作为标签。作者基于此现象对唾液酰转移酶催化的唾液酰化反应进行了研究。以MPB标记的乳糖（Lac-MPB）作为底物。在含有CMP-Sia的底物溶液中加入α2 - 6-唾液酰转移酶（Pd26ST）发生唾液酰化（图1j）。在反应一段时间后，能观察到6SL-MPB的信号（图1k），事件频率随反应时间的增加而增加，事件频率与反应时间的关系可以作为Pd26ST活性测定的指标（图1l）。

图2

作者接下来研究了AeL对其SL-MPB同分异构体的识别能力。图2a显示了6SL-MPB和3SL-MPB各自的事件分布。两种异构体混合测量时，也可以看到事件散点图的叠加（图2b）。通过比较事件的经验分布函数和优化Jensen-Shannon散度(JSD)来确定两种异构体在混合物中的权重。分别测量比例不同 6SL-MPB与3SL-MPB的混合物，预测权重与实际摩尔比对应关系良好（图2c），表明纳米孔传感有可能精确地确定混合物中聚糖的相对比例。

此外作者还对单糖数不同的聚糖衍生物进行纳米孔实验，分别测试二糖3SG-MPB、三糖3SL-MPB、四糖STetra2-MPB和五糖LSTa-MPB。随着聚糖长度的增加，I_b/I₀降低（图2d）。作者借助机器学习分类方法，用I_b/I₀与停留时间的散点图来指认聚糖。将四种聚糖的散点图叠加在一起，沿横纵轴等频将散点图分为9个区域（图2e），将每个区域中的数据的频率作为特征，9个特征的热图表明聚糖信号存在明显差异（图2f）。用五种机器学习模型都有很高的预测准确率，测试集预测准确（图2g，h）。说明机器学习辅助纳米孔传感可以明确地识别这些具有单糖差异的聚糖。

作者对不同分支的聚糖衍生物也做到了用纳米孔进行分辨。三种分支情况不同的异构体3S3FL-MPB、6S3FL-MPB和6S2FL-MPB被用于测试，I_b/I₀和停留时间的散点图如图2i所示。用同样的机器学习方法也能准确识别三种聚糖异构体（图2j，k）。进一步对LSTa的异构体LSTb、LSTc和LSTd进行相同衍生化的纳米孔测试，各聚糖的I_b/I₀与停留时间的散点图呈现出独特的模式（图2l-o），鉴于散点图的不同模式，这些五糖区域异构体可以被区分出来。

图3

后续作者将这种衍生化策略应用于中性聚糖传感。用唾液酸基糖作为载体，中间加入带负电的DPE单元来增加与纳米孔的相互作用（图3a，b）。Lac-DPE-6SL、Cel-DPE-6SL和Mal-DPE-6SL都可以给出信号（图3c），用改进的基于机器学习可以准确识别这些中性聚糖。用相同的标记步骤对两种分支中性三糖LeA和LeX进行了纳米孔测试。两种三糖衍生物LeA-DPE-6SL和LeX-DPE-6SL都产生了明显的阻塞信号（图3d，e）。此外，在衍生化后用AeL纳米孔测试了一对中性四糖LNnT和LNT。两种聚糖都产生了显著的阻塞事件，散点图较为相似（图3f，g）。这些结果表明，引入小的唾液聚糖作为载体，可以使中性聚糖衍生物被AeL纳米孔捕获和感知。

图4

最后作者对AeL的传感机理进行了描述。R282、R220、K238和K242残基是AeL纳米孔的关键敏感位点（图4a）。分别将这4个氨基酸突变为丙氨酸，改变孔道的电荷分布，如图4b所示，与WT相比，K238A和K242A表现出更明显的正整流现象，而R282A和R220A明显加强了负整流效应。然后，通过6SL-MPB对突变体进行测试，发现这几种突变体都会引起事件频率不同程度的减少（图4c）。R282A和R220A测得的6SL-MPB的事件特征与WT相似（图4d），但进入孔隙的难度较大。作者推断R282和R220残基的作用是平衡孔进入的静电势，并允许带负电荷的聚糖进入。进一步检查发现，K238A产生的堵塞深度要弱得多，而K242A引起的堵塞与WT相当。这表明K238残基在感知聚糖衍生物方面发挥了关键作用。为了进一步揭示K238残基的作用，作者还模拟了K238与6SL-MPB的相互作用。K238残基和MPB标签的Ar基之间存在两个阳离子-π对（图4e）。同时，还观察到糖羟基与多个氨基酸残基之间存在多个氢键，唾液酸羧基与K242残基之间存在盐桥（图4f），可能存在多重相互作用。

总之，本文通过将聚糖分子与含有芳香基团的标签衍生化连接后，通过纳米孔检测，可以产生显著的电流阻塞。用机器学习辅助方法可以对纳米孔数据进行分析，可以识别聚糖的不同异构体、具有可变单糖数的聚糖和不同的分支聚糖。提出的聚糖纳米孔传感策略为纳米孔聚糖分析和潜在测序铺平了道路。