聚糖是碳水化合物的链状组装体，在众多细胞活动中发挥着多种多样的重要功能。聚糖的功能与其高度复杂的结构相匹配，而这些结构多样性来源于单糖组成、糖链分支、糖链立体异构以及蛋白修饰的差异等等。无与伦比的结构多样性导致聚糖含有丰富的潜在信息，远远超过核酸和蛋白质，这也对聚糖的结构分析提出了巨大的挑战。目前分析方法主要依赖于结合基因手段或蛋白质组学，应用质谱、色谱、核磁共振光谱等等，然而聚糖生物合成的非模板驱动导致其结构异质性被放大，目前检测技术的局限性也很明显，例如质谱本身无法解析聚糖异构体，核磁方法又通常需要高样品消耗量和相当长的分析时间。

纳米孔技术在DNA测序等方面取得的巨大成功激励着科学家探究使用纳米孔对聚糖进行识别和测序。理论上，聚糖分子施加电压后通过纳米尺寸的孔时会破坏恒定的离子电流产生电信号，因此可以检测到聚糖，并根据特异性电流阻断信号辨别不同聚糖。尽管前景诱人，但聚糖的纳米孔传感在过去十几年里进展甚微，只有少数案例关注了透明质酸、肝素等高分子量多糖，对于更小但结构更多样化且具有生物学意义的聚糖（如N-聚糖或O-聚糖等）目前尚未实现纳米孔单分子检测，主要因为聚糖尺寸小且与纳米孔的亲和力较弱，无法感知聚糖快速通过纳米孔，以及大多数聚糖固有的电中性阻止其进入纳米孔。本文中作者通过高效简便的化学衍生化将芳香型标签引入聚糖，以通过气溶素 （AeL） 纳米孔实现聚糖传感（图 1、a、b） ，并且可以明确区分识别不同的聚糖异构体、不同长度的聚糖和支链聚糖。

用于纳米孔检测的聚糖衍生化

可用于纳米孔检测的分析物通常带电，因此作者首先选择带负电荷的唾液酸聚糖来进行纳米孔测试。作者采用了野生型 AeL 蛋白纳米孔，其最窄孔径为 ~1.0 nm可以更好地匹配小聚糖分子的大小。添加到 AeL 纳米孔的顺式侧溶液中的三糖 6'-唾液酸乳糖 （6SL）和3'-唾液酸乳糖 （3SL）未能在 +100 mV 下引起可识别的电流阻塞信号（图 1c ），并且增加施加的电压或电解质的盐浓度没有改变这种情况，表明AeL 纳米孔无法感知这些小的唾液酸化寡糖，这可能是由于这些聚糖的尺寸较小和/或与纳米孔界面的相互作用较弱，因此，如何增强聚糖与纳米孔的相互作用成为纳米孔传感的关键。

随后，作者举例了检测唾液酸转移酶催化活性的应用实例。携带 MPB 标记的乳糖 （Lac-MPB） 作为底物，将 α2-6-唾液酸转移酶 （Pd26ST） 添加到含有辅酶胞苷-5'-单磷酸-N-乙酰神经氨酸 （CMP-Sia） 的底物溶液中时，由于Lac-MPB、CMP-Sia和副产物CMP不会造成堵塞，反应一段时间后从加入的反应液中观察到的明显堵塞归因于唾液酸化产物（即6SL-MPB），并且事件分布与 6SL-MPB 的事件分布非常匹配（图 1j，k）。此外，信号频率随反应时间增加，时间依赖性信号频率可以作为 Pd26ST 活性测定的指标（图 1l），因此纳米孔传感为唾液酸转移酶活性测定提供了一种高度灵敏的方法。

鉴定聚糖异构体、具有不同长度和分支的聚糖

接下来检查 AeL 纳米孔对聚糖混合物的识别能力。作者首先尝试检测三糖异构体6SL-MPB 和 3SL-MPB的不同摩尔比混合物（图 2a），过比较纳米孔信号的经验分布函数和优化 Jensen-Shannon 散度 （JSD）来确定两种异构体在混合物中的各自比重，得到的预测摩尔比与实际摩尔比紧密地散布在y  =  x的线周围（图 2c），证明了适用的算法可以使纳米孔传感具有精确确定混合物中聚糖相对比例的潜力。

随后，作者分别进行了不同链长的线性聚糖混合物（图 2d）、三种含有支链岩藻糖的 MPB 标记唾液酸聚糖混合物（图 2i）、以及三种五糖异构体混合物的纳米孔传感测量（图 2i-o）。为了根据具有细微差异的纳米孔数据实现对分析物的明确识别，作者使用了基于机器学习的特征分类算法，根据I_b / I₀ vs 停留时间的散点图生成数个特征，再根据所有特征的热图来显示了聚糖之间的明显差异（图 2e、f、g、h、j、k）。在三种聚糖混合物纳米孔检测实验中，基于机器学习方法来构建的模型都报告了超高精度，显示了纳米孔传感在识别支链聚糖与区分聚糖异构体方面的潜力。

中性聚糖的纳米孔检测

为了检测中性聚糖，根据唾液酸聚糖衍生物会纳米孔电流信号这一特点，作者设计了中性聚糖修饰策略（图 3a），其中 6SL 将充当载体以确保 AeL 捕获，而中央 Ar 单元负责增加与纳米孔的相互作用。基于此，6SL 首先被标记为 4,4'-二氨基二苯醚得到 6SL 衍生物（6SL-DPE-NH 2）作为复合标签，进一步连接到乳糖的还原端，得到的乳糖衍生物（Lac-DPE-6SL）确实在 AeL 纳米孔中引发了明显的电流信号，并且特征分布的停留时间与复合标签本身的停留时间不同。另两种中性聚糖异构体纤维二糖（Cel-DPE-6SL）和麦芽糖（Mal-DPE-6SL）通过纳米孔测试，由于三种二糖之间 C4 或 C1 立体化学的微小结构差异（图 3b），它们的散点图表现出相似的分布（图 3c），但仍可使用基于机器学习的分类方法并报告了高达 96.34%的准确率, 表明这些中性差向异构二糖的成功区分。在另外的支链三糖与四糖异构体中表现出一样的结果（图 3d-g），表明引入小的唾液酸聚糖作为载体可以使中性聚糖衍生物被 AeL 纳米孔捕获和感应，从而实现纳米孔感应和二糖、支链三糖和四糖水平的异构区分。

最后，作者通过对纳米孔关键位点氨基酸突变，R282、R220、K238 和 K242 残基是 WT AeL 纳米孔的关键传感位点（图 4a），通过单点突变将四种氨基酸突变为丙氨酸获得四种突变体：R282A、R220A、K238A和K242A。结合位阻分析、电性分析以及基于分子对接的动力学模拟，作者发现了K238 残基（来自链 C 和 D）和 MPB 标签的 Ar 基团之间的两个阳离子-π 对相互作用。同时还观察到糖羟基和几个氨基酸残基之间的多个氢键，以及唾液酸的羧基和 K242 残基（链 A）之间的盐桥（图 4f）, 表明多重相互作用的可能性。作者推断，在带有 Ar 标签的聚糖衍生物的易位过程中，强阳离子-π 相互作用作用于 AeL 孔最窄收缩处的 K238 残基上的 Ar 标签，延缓了聚糖衍生物的易位。氢键和/或盐桥相互作用可能会加强这种延迟，最终导致 AeL 纳米孔可以检测到的堵塞信号。

总之，作者展示了通过引入简便的聚糖衍生化策略，可以使用野生型气溶素纳米孔AeL实现聚糖传感。聚糖分子在与含有芳香族基团的标签（或加上中性聚糖的载体基团）连接后穿过纳米孔时，会引起明显的电流阻塞。获得的纳米孔数据可以独立地或使用机器学习方法区分聚糖中不同单糖数量、聚糖区域异构体、立体异构体和聚糖支链异构。所提出的聚糖纳米孔传感策略为纳米孔聚糖分析和潜在测序铺平了道路。

本文作者：HBQ

原文引用：https://www.nature.com/articles/s41467-023-37348-5

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