糖基化是蛋白质翻译后修饰最丰富多样的形式之一，参与细胞粘附、分子运输和清除、受体激活、信号转导和胞吞作用等众多生理过程。糖基化的改变也与许多人类疾病如癌症密切相关，恶性肿瘤特异性聚糖已显示出作为潜在生物标志物的潜力。然而，由于缺乏有效的聚糖特异性亲和试剂，基于蛋白质糖基化的癌症诊断与治疗方法的开发受到了极大的阻碍。

近期，斯坦福大学H. Tom Soh课题组提出了一种能够生成、筛选具有吲哚修饰的核酸适配体的方法，以识别和区分特定的蛋白糖型。该研究结果发表在Nat. Commun.上，题为Discovery of indole-modified aptamers for highly specific recognition of protein glycoforms。

首先，作者通过他们之前所建立的多参数粒子显示（MPPD）技术对N-聚糖结合适配体进行了筛选。MPPD筛选过程如图1所示：先通过乳液PCR将液相中的适配体文库转化为单克隆适配体颗粒，并与具有不同荧光标记的靶分子、非靶分子一起孵育；然后对其进行荧光激活细胞分选（FACS），识别出能够产生强烈的目标特异性信号、而且非目标荧光最小的粒子亚群；最后对收集到的适配体颗粒进行逆转录，用于后续的筛选或测序。

作者将5-Indolyl-dUTP直接加入到乳液PCR过程中替代dTTP，以生成带有吲哚修饰的适配体。作者采用了AF-647标记的RNase A（RA）和AF-488标记的RNase B（RB）对适配体进行筛选。这两种蛋白质的氨基酸序列相同、结构相同，不同之处在于RB多了一个N-糖基化位点。

图1 MPPD流程

在对初始适配体文库进行预富集之后，作者进行了两轮MPPD筛选。其中，在AF-488通道中产生增强信号但在AF-647通道中没有增强信号的适配体颗粒，能够与RB特异性结合。如图2a所示，随着筛选的进行，荧光信号明显增强，表明对RB的亲和力增强。此外，如图2b所示，与RA的结合基本不变（象限Ⅱ），与RB的结合增加（象限Ⅳ），同时结合两种蛋白的事件减少（象限I），表明聚糖特异性适体成功富集。

图2 筛选结果

接下来，作者对筛选出来的RB适配体进行了测序，并从中选择了7个候选适配体（i-1-7）进行了表征。如图3a所示，这7个候选适配体都显示出较强的RB结合能力和较小的RA结合能力。其中，i-6对RB的结合能力最强，作者又对其进行了结合曲线的测量（图3b）。此外，作者也合成了不含吲哚修饰的i-6以及顺序打乱的i-6，均不能结合RB，说明吲哚是适配体识别的关键，并且这种结合不仅仅是由于吲哚与N-聚糖之间的非特异性相互作用引起的。

同时，作者也证明了i-6并不是简单地与任何聚糖结合，而是对高甘露糖型N-聚糖具有识别能力（图3c-e）。溶液中游离的高甘露糖型N-聚糖可能会与RB产生竞争，但相较之下，适配体与RB的结合能力会更强。

图3 RB适配体的表征

接下来，为了证明该方法是一种可推广的筛选糖基化特异性适配体的策略，作者又筛选了能够识别胎球蛋白糖基化的吲哚适配体。其中，作者没有直接加入含有碱基修饰的类似核苷酸，而是在PCR步骤之后，使用点击化学方法进行碱基修饰。从图4a中可以看出，作者筛选的7个候选适配体（f-1-7）都表现出较强的胎球蛋白结合能力，而对于无唾液酸胎球蛋白结合能力较弱。然后，作者又选择了结合能力最强的f-4进行下一步表征，测量了其结合曲线（图4b）。

图4 胎球蛋白适配体的表征

最后，作者验证了RB适配体i-6是否会与细胞表面大量表达的N-聚糖结合。作者采用了一种基于凝集素的定性凝集分析方法。如图5a所示，阴性对照组（链霉亲和素磁珠未偶联i-6）图像显示磁珠分散，与固定细胞没有相互作用。图5b中，刀豆蛋白A（ConA）偶联的链霉亲和素磁珠形成了密集的聚集体，因为ConA能够结合细胞表面的高甘露糖型N-聚糖。而图5c中，i-6偶联的链霉亲和素磁珠也出现了这种现象；但是在ConA处理后的细胞中加入i-6偶联的链霉亲和素磁珠，并不会产生聚集（图5d）。图5e为图5d中粒子大小的分布。这些现象证明了吲哚修饰的适配体可能可以用于检测细胞表面表达的聚糖。

图5 细胞表面聚糖的识别

总的来说，本文提出了一种生成特异性识别蛋白质糖型的吲哚修饰适配体的方法，所得到的适配体对结构相同、仅相差一个糖链的蛋白质也能够表现出选择性。在未来，该方法也可以扩展到其他适配体碱基修饰的探索，以帮助生成糖型特异性适配体，扩大糖生物学工具箱的范围和用途。

陈佳璐

黄硕课题组2021级直博生