分享一篇来自“J.Am.Chem.Soc.”的文章，名叫“Toolbox of Fluorescent Probes for Parallel Imaging Reveals Uneven Location of Serine Proteases in Neutrophils”。这篇文章的通讯作者是来自弗罗茨瓦夫理工大学化学生物学与生物影像学系的Marcin Drag教授，该课题组开发了一种新的化学方法，称为HyCoSuL（混合组合底物库），用于剖析蛋白水解酶的广泛底物特异性。能够在 HyCoSuL 结构中使用天然和非天然氨基酸作为底物库，用于发现针对多种蛋白酶的高活性高选择性底物、抑制剂和活性探针。中性粒细胞中能表达四种丝氨酸蛋白酶 (NSP)，它们在控制细胞信号通路和防御病原体方面发挥重要作用。这四种蛋白酶分别是中性粒细胞弹性蛋白酶 (NE)、组织蛋白酶 G (CATG)、蛋白酶 3 (PR3) 和中性粒细胞蛋白酶 4 (NSP4)，也称为 PRSS57。这些蛋白酶通过趋化因子激活、细胞受体激活和细胞内病原体破坏的非氧化途径以及嗜中性粒细胞胞外陷阱 (NET) 的产生参与细胞信号传导的控制。由于中性粒细胞是终末期细胞，半衰期短，正在进行的蛋白质合成最少，所以单独分析 NSP 在人类中的作用是有障碍的。为了解决这一问题，文章开发了一套高选择性 NSP 小分子化学工具，使其能够监测每个 NSP 在中性粒细胞中的作用。HyCoSuL是一个通过筛选不同氨基酸组合的肽基底物库，根据结构性质不同的非天然氨基酸以及天然氨基酸排序，并产生一个底物偏好矩阵，使其对某一蛋白酶具有特异的底物偏好性。其中 P1 残基 (X) 根据每个 NSP（Phe、Arg 或 Ala）的已知主要特异性固定，而P2、P3 和 P4 随机分配有天然和非天然氨基酸。接着，选择的最佳序列将被合成为单独的底物，并针对所有 NSP 进行扫描以发现最具选择性的序列。再对选择性最好的底物候选物进行动力学表征，以k cat / K m值和选择性比率为特征，并构成进一步分析的序列基础。结果表明，四种NSP都有各自筛选出的特异性底物。但NE的底物与PR3还是存在轻微的交叉反应，以及PR3的候选底物也能识别NE。为了开发仅与活性形式相互作用的成像探针，并能够评估它们在中性粒细胞功能和疾病期间的个体活动状态。研究将筛选出的候选底物序列转换为基于活性的探针，使其能一个复杂的混合物中选择性地标记每种NSP。实验给每个探针添加了N端生物素或四个荧光团（BODIPYFL、Cy3、Cy3、Cy5或Cy7）其中的一个，以及添加了一个与每个NSP的P1偏好相关的二苯基膦酸盐衍生物作为亲电共价弹头，同时添加了PEG作为连接元件避免标签和识别序列相互作用。
图2：每种NSP探针结构设计策略然而由于NE探针与PR3的交叉反应性，为了能够特异性地在复杂的混合物中识别PR3、CATG和NSP4。需要寻找另一种方法来区分这两种密切相关的蛋白酶。实验将每个Cy5探针与其目标分离的酶或其余三个NSP的混合物孵育。结果表明：CATG、PR3和NSP4都被各自的Cy5探针特异性标记，但NE探针PK105同时也标记了NE缺陷混合物中的一个组分。后续进行进一步的验证，实验还诱导蛋白胞吐从而获得NSP的混合物，将这些提取物与单个探针孵育，并用特异性抗体捕获每种酶，证实了PK205和PK305探针只与靶向酶结合（特异性好），而PR3与PK305和PK105探针结合（特异性有待提升）。基于活性的探针基本上有两种方法可以用于处理中性粒细胞蛋白酶的功能。一种是需要用探针（饱和）来完全抑制每一种酶，另一种是添加微量的探针，以跟踪每种酶的位置而不影响它们的整体功能。实验最终发现，在添加NE探针之前，将PR3探针与中性粒细胞孵育后再微量标记浓度下提供NE探针，即可解决原来NE探针特异性不佳的问题。实验后续根据探针标记的荧光强度信号对中性粒细胞中的NSP蛋白进行了定量。活性NSP浓度（在107个细胞/mL中测定），NE为230~340nM，PR3为150~530nM，CATG为75~188nM，NSP4的浓度为17~34nM，与之前文献数据表述基本一致。NSP在高尔基体中被加工成活性形式：首先去除一个短的N端二肽，然后除一个C端肽。为了测试NSP是否被分类并定位到相同的位置上，实验用不同的荧光团对每个特定的探针进行编码，并将其与新鲜制备的未受刺激以及PMA刺激的中性粒细胞孵育。成像结果显示，单个NSP似乎具有不重叠的点状分布。对于这一意料之外的结果，实验假设是由于探针的某些特性导致了不均匀的分布。为了测试这种可能性，选择了三种策略。在第一种方法中，为每个NSP孵育了两种不同的荧光团标记探针（Cy5和BODIPY FL），观察不同的标签是否会改变定位。第二种策略为使用了针对单个酶的特异性抗体，并与三种配备了不同荧光标签的二抗结合；第三种策略为使用了选择性的NSP探针，然后用特异性抗体进行固定和染色。成像结果都证明：无论可视化标签是什么类型的，都是针对中性粒细胞内的相同定位，并且通过互补的方法，证实了NSP在单个中性粒细胞内是存在错位分布的。后续，研究使用流式细胞术根据其NSP含量/载量对细胞进行分选。使用流式细胞术用探针揭示 NSP 的共定位程度。通过这个实验证明，仅计算出只有 0.2% 的嗜中性粒细胞总量具有包含所有四种酶的颗粒，而大部分的嗜中性粒细胞中只含有一种NSP酶。另外，因为这些细胞终末分化并且不合成颗粒蛋白，蛋白质从反式高尔基体网络靶向中性粒细胞的机制仍未确定。NE 和 CATG 在封装过程中经过两个处理步骤。第一个是去除产生蛋白水解活性的 N 末端二肽。第二个是 C 末端肽的去除。NE 的 C 末端包含一个衔接蛋白 3 (AP-3) 信号（该信号在之前就被建议为提供的分选信号）。因此研究预测它们可以提供一种嗜中性粒细胞的特殊分选功能。 图5：NSP探针共定位效果及NSP在细胞中的含量分布该文章通过一种（HyCoSuL）肽底物文库的方法成功设计出了一套可以特异性标记NSP家族蛋白的探针，从而实现在同一时间和地点同时对几种活性形式的酶进行成像的结果。这些选择性荧光探针能够解决中性粒细胞中活性 NSP 的定位问题，从而可以辅助研究相关生理过程。这种方法的实用性在未来可以很容易地扩展到其他蛋白酶组，用于研究更多其他生物过程。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.7b04394原文引用：https://doi.org/10.1021/jacs.7b04394
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