泛素化是重要的翻译后修饰，可调节细胞功能的几乎每个方面。泛素可以形成不同的拓扑链，其中每种在决定被修饰蛋白的功能和命运方面都具有独特的作用。去泛素酶（DUB）从靶蛋白上去除泛素（Ub）的关键翻译后修饰。DUB在治疗人类疾病方面具有重要的研究潜力，因此DUB如何识别蛋白质链成为重要的研究课题。USP9X是一种保守的去泛素酶（DUB），可调节多个细胞过程。USP9X的失调与癌症和X连锁的智力障碍有关。本研究中作者及其团队获得了USP9X催化核心（涉及癌症和发育障碍的DUB）的原子细节，并使用一组基于活性的泛素探针揭示了其异常的作用机理。这些探针将推动对DUBs如何识别和处理泛素蛋白链的研究，并确定DUBs上潜在的新位点来推进药物设计。

       在对USP9X CD的结构进行分析之后，作者又测定了其DUB活性。发现USP9X不同于其他UBLs,仅对泛素具有活性。并且评估了USP9X CD对八个具有不同连接方式的diUb底物的活性。

        同时为了研究USP9X的三个潜在的结合位点，作者设计了一系列的ABPs。基于经过DUB切割的化学键系统地命名ABP，这些化学键可以是可切割的天然肽键（CL），不可切割的连接（NC），迈克尔受体（MA）头部或特定反应基团的缩写，后跟一个数字以表示断裂键的位置。合成了这些ABP之后，并通过质谱法对其与酶的作用特性进行了表征。

        尽管许多功能尚未阐明，但在许多USP中都发现了存在于手指亚结构域中的ZnF基序。为了评估USP9X的ZnF的作用，作者突变了与锌离子螯合的残基，C1727A或H1729A，并测定了它们的活性。分析发现C1727A突变体裂解活性降低，证明了ZnF在S1位点与Ub结合的重要性。同时为了测量ZnF对S2-S1 diUb结合的影响，进行了时间依赖性标记。结果表明，K11-diUb-NC1-PA2探针的标记效率明显降低，但K63-diUb探针的标记效率几乎没有变化。这些结果表明，USP9X中的ZnF在diUb的链键特异性识别中起重要作用。

        同时作者发现CYLD序列框6的插入对于识别M1-和K63-diUb中的近端Ub很重要。而USP9X CD的方框6中的插入可以起到类似的作用。为了了解USP9Xβ-发夹插入的作用，作者生成了一个缺失突变体Δ（1924–1943）。通过对其活性以及探针标记研究结果表明，去除β-发夹插入对S2-S1 Ub结合的影响最小。接下来，作者使用diUb-MA1探针对S1-S1'位点进行了研究。并通过凝胶对裂解结果进行了分析，发现β-发夹缺失会显着降低切割效率。总体而言，β-发夹插入对于S1-S1'的裂解活性很重要。

        在用不同链接的diUb-MA1探针进行的WT USP9X CD标记实验中，作者观察到了标记模式的有趣差异。当使用K11-diUb-MA1探针时，观察到了两个强度相当的标记带，将其标记为HMW和LMW带（对于高分子量和低分子量）。对HMW和LMW谱带进行了胰蛋白酶消化和MS / MS分析。结果表明，K11 diUb-MA1探针与封闭环BL1上的Cys1808结合产生了HMW带，而催化Cys1566的标记导致了LMW带。这表明USP9X CD中Cys1808的交替标记需要K11-diUb-MA1中的近端Ub。

       基于以上的研究作者提出了三种可能的结合模式，其中两种导致链的裂解（内切和外切）。为了探测Ub底物同时结合所有三个潜在DUB Ub结合位点（S2，S1和S1'，模式1）的作用，使用了triUb-NC1-CL2探针，表明其属于内切模式。然而，几乎没有检测到K48 triUb-NC1-CL2的切割。接下来，使用triUb-MA1-CL2探针在一种测定中通过DUB检测内切和外切模式。作者设想了三种可能的结果，在方案1中，DUB以导致triUb-MA1-CL2的内切模式与triUb底物结合，从而，产生di-和monoUb产物。所得的diUb-MA1探针可能会依次标记DUB。在方案2中，DUB仅以外结合模式与triUb底物结合，从而导致triUb探针标记DUB。在方案3中，内结合或外结合模式都是可能的，这将导致triUb在天然异肽键处同时裂解，并被triUb探针的头部标记。并且对相应的探针进行分析也证实了这三种模式。