ACS Central Science上的一篇文章，Direct Profiling the Post-Translational Modification Codes of a Single Protein Immobilized on a Surface Using Cu-free Click Chemistry，本文通讯作者是来自于韩国浦项工科大学化学系的Kimoon Kim和生命科学系的Sung Ho Ryu。Kimoon Kim教授是韩国浦项工科大学做超分子材料方面的专家，Kimoon Kim组研究的新兴材料，具有独特的物理和化学性质，可用于包括催化、蛋白质组学、组织工程、生物传感器、生物成像等等多方面应用。Sung Ho Ryu教授的主要研究方向是运用蛋白质组学技术研究细胞内分子信号转导等过程。

蛋白的多种翻译后修饰（PTMs）对其功能调节非常重要，传统的western blotting 和质谱是最常用的检测PTMs的方法。但是这些方法只能检测多个蛋白分子的平均修饰，无法具体分析到每一个蛋白质分子上同时有哪些修饰存在，进而无法了解这些组合的PTMs对于蛋白功能的影响。

在本文中，作者发明了一种“可擦除单分子印迹”（eSiMBlot）方法对单个蛋白质分子组合的PTMs进行鉴定。作者通过Cu-free的click反应将一种蛋白质固定在材料表面上，用一抗与蛋白某一位点特定PTM进行结合，再结合荧光二抗来进行荧光显微镜进行成像。成像结束之后用erasing buffer将抗体全部洗掉，重新用别的修饰的抗体再次结合。由于每一个蛋白质分子的位置是固定的，它上面有哪几种修饰都可以通过荧光显微镜分别鉴定到，将修饰们组合起来，就可以得到每个蛋白质分子的PTM码。这就像是western blotting的升级版，区别是它可以得到每一个分子的多种翻译后修饰情况，而western blotting只能得到一群蛋白质的平均修饰情况。

要实现作者的目的，首先要解决的几个问题。1.如何将蛋白质牢固的固定在材料表面；2.如何提高不同抗体对抗原的检测效率以避免失真；3.如何确保每一轮“擦除”抗体的效率，以免影响下一轮的成像。针对以上问题，作者首先将玻璃材料表面嵌入氨基，再通过酰化反应将一端连有羧基的聚乙二醇PEG链连接到氨基上，PEG另外一端连有叠氮基团，同时将要分析的蛋白上连接上二苯并环辛基基团（DPCO），叠氮基团和DPCO发生环张力促进的click反应，通过稳定的共价键将蛋白固定在材料表面。作者通过多轮重复检测同一抗原的办法来提高抗原的检测率，以及用低PH和低表面活性剂的buffer确保抗体可以被全部洗去。

解决了这些技术问题后，作者就将该方法用于EGFR酪氨酸磷酸化修饰的分析。作者分别进行了in vitro和in situ的研究。过表达SNAP-EGFR-eGFP-Flag蛋白，in vitro实验中通过加入ATP促进其磷酸化，再通过SNAP tag将DPCO连接到蛋白上，然后将蛋白固定到材料表面，从而进行鉴定。作者发现in vitro中，共有26-1=63种酪氨酸磷酸修饰码，而且EGFR上的6个酪氨酸全部磷酸化的蛋白比例高达18%，而单个酪氨酸磷酸化的比例大大降低。而在in situ实验中，由于内源脱磷酸酶的存在，绝大多数蛋白中都只存在一个酪氨酸磷酸化修饰，而加入配体EGF处理也没有变化，加入脱磷酸酶抑制剂处理，蛋白分子中含单磷酸化比例略有减少，含多个酪氨酸磷酸化比例升高。这有力支持了作者之前的研究结论，EGF只能诱导细胞膜上EGFR单个磷酸化，而非多磷酸化。

总之，本文开发了一个eSiMBlot方法分析单个蛋白分子多种PTMs，用于分析在生物通路里面组合的翻译后修饰，这种方法快速简单又高效，是一种非常有力的研究工具。缺点是必须将要研究的蛋白分子固定在材料表面，这就需要对蛋白进行一定的改造。无法像western blotting一样可以直接对某些内源未经改造的蛋白的修饰进行检测。

DOI: 10.1021/acscentsci.8b00114

Link：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.8b00114