ACS Cent. Sci. | 保守的蛋白-聚合物间相互作用是偶联物热稳定性改变的基础

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分享一篇近期发表在ACS Cent. Sci.上的文章,题为Conserved Protein-Polymer Interactions across Structurally Diverse Polymers Underlie Alterations to Protein Thermal Unfolding文章的通讯作者是来自佛罗里达大学的Matthew T. Eddy教授。

    蛋白质-聚合物偶联物具有广泛的临床及工业应用。但偶联物的开发很大程度上仍依赖于经验,理性设计具有可预测化学性质的偶联物依旧是不小的挑战。通过获取更多的实验数据,建立对蛋白-聚合物间相互作用的分子理解,将有利于明确聚合物结构与偶联物有益特性间的关系。

    本文中,作者以人半乳糖凝集素Gal3C作为模型蛋白,制备了修饰有聚乙二醇PEG,聚(二甲基丙烯酰胺)PDMA,以及聚(寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯)POEGMA的偶联物,并测试这些不同结构聚合物对蛋白热稳定性的影响,如图1所示。其中,PDMAPEG类似,均为呈无规线团的线性聚合物,而POEGMA则为梳状,同时,侧链的寡聚乙二醇长度与热转变温度相关。

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1. 聚合物性质及蛋白偶联路线


   首先,作者通过RAFT聚合合成了5种聚合物(图1C),其中P(OEGMA500)21PDMA61PEG121在流体力学尺寸上相当;为研究梳状聚合物侧链的影响,制备了与P(OEGMA500)21聚合度接近,但侧链更短的的P(OEGMA300)20RAFT聚合物通过两步反应获得末端马来酰亚胺官能化,分子量、端基修饰均通过SEC与核磁进行表征。

    随后,使用Grafting to方法进行蛋白偶联,反应条件如图1A所示。经过SEC的纯化步骤,通过配体结合测试确定偶联物的功能未受到影响。

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2. HSQC核磁测定聚合物对偶联物骨架结构的影响


    接下来,为了在原子尺度上评估聚合物修饰对蛋白骨架结构以及构象动力学的影响,作者制备了15N标记的偶联物,并进行了二维异核单量子相关光谱([15N, 1H]-HSQC)。图2分别为PEGAD)、PDMA61BE)、P(OEGMA500)21CF)偶联物相对于未修饰蛋白上不同残基酰胺信号的化学位移扰动及谱线增宽情况。灰色框中则突出显示了PEG修饰导致的显著扰动区域。从图中可见,线性PDMA61PEG对蛋白有类似的影响模式,紧凑的构象使其对偶联位点附近的残基影响最大。而P(OEGMA500)21数据中能观察到更多残基的谱线增宽,图2F也直观反映出蛋白上远离C243位置更广泛区域的变化。这也不难理解,P(OEGMA500)21具有许多分支,在溶液中采用更为延伸的构象。

    接下来,为探究聚合物长度与结构对热稳定性的作用,作者进行了圆二色光谱的线性加热实验。在之前的研究中,作者发现,PEG修饰的Gal3C通过形成一个解折叠中间体,改变了蛋白的解折叠途径,使Tm值明显提高。因此作者取不同聚合度的PDMA(图3B-D)中的离散纯化组分(图3E-G)分别进行测试。由图4H-J所示,低分子量的PDMA10没有观察到中间体,而分子量较高的PDMA39PDMA61具有类似的热展开图像。由此可以得到结论,线性的PDMA需要达到一个阈值的聚合物长度,以形成热展开的中间产物。

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3. PDMA偶联物制备及热熔曲线


    类似的,作者比较了P(OEGMA500)21 P(OEGMA300)20的热展开情况。如图4G所示,P(OEGMA300)20的低分子量部分(CD)尽管表现出了较未修饰蛋白质更高的Tm温度,但缺乏明确的中间体,这一结果同样表明聚合物长度存在阈值。另一方面,侧链较短的P(OEGMA300)20未观察到中间体(4F),表明其较强的疏水性可能减少了蛋白与聚合物间的相互作用,而这对重新指导蛋白热展开途径是必需的。

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4. POEGMA偶联物制备及热熔曲线


    总结来看,本文的研究表明线性与非线性不同聚合物修饰的蛋白偶联物均能够得到热稳定性的改善。核磁分析表明,非线性的聚合物更多的采用延伸构象,覆盖蛋白更多的表面,延伸至离偶联位点更远的位置。同时,不同结构聚合物可能产生相似的解折叠中间体,但解折叠途径也表现出对聚合物长度及分支长度的依赖性。


作者:ZRC  审校:WLT

DOI: 10.1021/acscentsci.2c01522

Link: https://doi.org/10.1021/acscentsci.2c01522


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