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图1 共价NA-蛋白质生物偶联物的制备策略。
图2 5 ' -氨基DNA ONs的修饰及BA标记产物的LC-MS表征。
在完成氨基修饰ONs的标记后,需要进一步将BA标记的ONs偶联到蛋白质和抗体上。为了精确表征这些结构以生成位点特异性和化学计量(1:1)DNA -蛋白偶联物,作者对LC-MS分析方法进行了优化。利用BA标记的ON 5'-BA-ss11-mer与抗非洲爪蟾核孔蛋白复合物594Nup98 G85C制备偶联物(图3a),与使用甲酸作为LC-MS添加剂相比,乙酸铵在10 mM浓度下,得到了更清洁的提取离子系列(图3b),其质量与预期质量吻合。同时,10 mM甲酸铵对样品电离有明显影响,但总质量离子的解卷积和重建与10 mM 乙酸铵有相似的结果(图3b)。利用优化后的LC-MS方法对制备的偶联物进行表征,观察到解卷积质谱与观测质量范围的结果都是准确的(图3c)。
在优化了LC-MS分析方法和DNA -抗体偶联物表征的条件后,作者进一步探索了该偶联方法对不同尺寸蛋白质的适用性及反应性。作者成功地将5 ' -BA-ss11-mer与四种不同的蛋白偶联,并使用不超过10个当量的BA标记ON(图4a)。通过将不同长度的单链或双链ON偶联到C2Am-C95上,证明本文开发的偶联方案适用于不同类型BA标记的ONs(图4bc)。随后,作者将其扩展到抗体上,证明目标蛋白的目标半胱氨酸残基是唯一可以成功偶联 5'-BA-mers 修饰的氨基酸残基(图4d)。除了全长的单克隆抗体,作者还将该偶联方法应用于单域抗体以及四种BA标记的ONs(图4e),通过 LC-MS 进行表征后其质量均与预期一致。各种长度BA标记ONs成功地与一系列不同的蛋白质和抗体偶联,清晰证明了这种简单而强大的生物偶联方法不仅可以可提供位点特异性的DNA-蛋白质偶联物,还具有多功能性。
图4 位点特异性NA-抗体偶联。
随后,作者测试了制备的DNA-抗体偶联物(2Rb17c-C138-ss11-mer)的血浆稳定性,在四个不同时间点采集样品通过LC-MS进行分析(图5a),没有观察到分解现象,这有力地证明了其血浆稳定性。此外,将制备的Thiomab LC-V205C-ss11-mer 和 2Rb17c-C138-ss11-mer 偶联物用作 DNA-PAINT超分辨率显微镜实验中的探针,证明了制备的两种DNA-抗体偶联物都保留了它们的靶标受体结合活性。最后,为了进一步了解制备的生物偶联物在细胞内的运输和定位,落射荧光显微镜成像的结果提供了受体介导的DNA-抗体偶联物内化的定性证据,表明DNA ON仅在与抗体偶联时才能有效递送到细胞内(图5c)。
图5 生物偶联物的完整性研究和细胞成像实验。
总的来说,作者开发了一种DNA ONs与蛋白质/抗体的生物偶联优化方案,展示了该方案的通用性,提供了位点特异性的DNA-蛋白质偶联物。这项工作开发的生物偶联平台具有靶向递送治疗性NA的潜力,有望进一步研究和发展更有效的癌症治疗策略。
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