荧光信号是流式细胞仪接收处理的重要信号，应用荧光技术使流式细胞术发生了质的飞跃，使流式细胞术发展成为广泛应用于基础生物医学研究和临床诊断的技术。流式细胞仪接收到的荧光信号来源于结合在样品细胞上的荧光素，荧光素偶联抗体或者荧光染料与细胞结合后就会使细胞带有相应的荧光素，该荧光素被相应激光激发后产生特定波长的荧光，分析该荧光信号的强弱就可以间接反映样品细胞的某些特征。

荧光素

荧光素（fluorochrome）多是一些化学试剂，有天然的、半天然的，也有人工合成的；还有些是蛋白质。荧光素在未被激发时外层电子处于基态，当被特定波长的激光激发后，外层电子接收到足够的能量就会跃迁到激发态，处于激发态的荧光素外层电子不稳定，会自发从激发态回到基态，同时释放出特定波长的荧光。这就是荧光素产生荧光的原理。

不同的荧光素有其特定的激发光和发射光，所以，流式分析时可以同时标记发射不同波长荧光的荧光素。这些荧光素被激发后发射的荧光被不同的荧光通道接收，它们之间的信号采集和分析不会相互干扰，从而使多荧光通道分析成为可能。

流式细胞术发展到现在，已经有很多种荧光素被用于流式分析。

一般荧光素

应用于流式细胞术的常用荧光素总结于下表中。

CFSE全称为羟基荧光素乙醋酸盐瑰珀酰亚胺脂；

注：该表不包括Alexa Fluor系列和QD系列荧光素。

FITC是流式细胞术最常用的荧光素，该荧光素较为稳定，与FITC偶联的流式抗体种类也最多。FITC由最常见的488nm激光器激发，其发射的荧光信号被第一荧光通道（FL1）接收。流式细胞术单色分析时常用FITC偶联的抗体。PE荧光素使用也较为广泛，也是由488nm激光器激发，发射的荧光信号通常被荧光通道FL2接收，其荧光信号较强，适用于弱表达的抗原分子的分析。流式细胞术双色分析时通常采用FITC和PE荧光素。

单激光器的流式细胞仪一般配备488nm激光器，可以同时进行3色分析，即有3个荧光通道，FL1接收FITC的荧光信号，FL2接收PE的荧光信号，FL3可以接收Percp或者PE-Cy5的荧光信号。因为Percp和PE-Cy5的荧光信号是被同一个荧光通道接收的，所以在流式分析时，不能同时使用这两种荧光素偶联的抗体。

APC也是较为常用的荧光素，其荧光信号也很强，同样适用于弱表达的抗原分子的分析，但是它不能由488nm激光器激发，而只能由635nm红激光器激发，所以488nm单激光器的流式细胞仪无法分析APC的荧光信号。如果流式细胞仪同时配备有635nm红激光器，就可以使用APC荧光素。如BD公司的LSRⅡ分析型流式细胞仪，可以同时进行4色分析，FL4接收的就是APC的光信号。

PE-Txred、PE-Cy7和APC-Cy7荧光素不常使用，一般只能在有更多荧光通道的流式细胞仪如9通道或者12通道的流式细胞仪上使用。CFSE和PKHI26荧光素不与抗体偶联，而是单独使用，CFSE能够与细胞膜上和细胞内的蛋白质非特异性结合，PKH26能够嵌入细胞膜的双分子层中，用于细胞示踪和检测细胞增殖等。

（E）CFP、（E）GFP和（E）YFP为指示蛋白，其中（E）GFP最为常用，常将其整合于基因组中，用于非特异性指示该转基因小鼠的所有细胞或者特异性指示某种细胞；（E）CFP和（B）YFP是一对理想的能够实现荧光共振能量转移的荧光素，可以用于检测蛋白质与蛋白质的直接结合。

Hoechst3312可标记活细胞，多用于分选侧群干细胞。

PI荧光素用于检测细胞的DNA含量，可用于细胞周期检测，此外PI也可用于区分活细胞和死细胞。

7-AAD用于标记死细胞，在需要明确区分活细胞和死细胞时使用。

TMRE对线粒体膜电位敏感，膜电位下降时结合减少，细胞调亡通常伴随着线粒体膜电位的下降，所以TMRE可以通过指示线粒体膜电位的变化检测细胞调亡。FAM在水中稳定，主要用于DNA自动测序，也可用于PCR产物定量和核酸探针等。

Fluo4是化学荧光钙离子指示剂，最常用于流式检测细胞内游离的钙离子水平。SNARF－AM对细胞内pH敏感，可用于流式检测细胞内pH，被488nm激光激发后能够发射640nm和575nm左右的两种荧光，两种荧光信号强度的比值与细胞内的pH呈一定的比例关系。

Alexa Fluor 系列染料

近年来，出现了一种名为Alexa Fluor 的系列染料，与一般荧光素相比，它具有多种优点：①比一般荧光素更亮，信号更强，更适用于弱表达抗原分子的检测分析；②光稳定性更强，不易被漂白；③仪器兼容性好，可以被常规配备的激光器激发；④ Alexa Fluor系列染料多达17种，这些染料发射波长从近紫外到近红外，选择范围广；⑤对pH耐受性更强，可以在更宽pH范围内保持其光稳定性；⑥水溶性好，无需有机溶剂就可直接结合蛋白质，而且长期储存也不易产生沉淀。Alexa Fluor系列染料的光谱特性见下表。其中很多种荧光素可以替代目前使用的荧光素，是更具竞争性和发展前景的荧光素，如最具有代表性的Alexa Fluor488可以替代最常用的流式荧光素FITC，具有亮度更高pH耐受性更好、光稳定性更好的优点。

无机荧光素QD

以上介绍的都是有机荧光素，随着纳米技术的发展，最近还出现了无机荧光素QD（quantumdot）。QD由半导体纳米品体组成，目前有8种供流式检测选用，根据QD发射光的平均波长来命名，分别为QD525、QD545、QD565、QD585、QD605、QD655、QD705和QD800。QD发射光波长与其纳米晶体核心的大小有关，QD525核心最小，只有4nm，QD800核心最大，为8nm。QD对于激发光的波长要求较低，原则上只要低于其发射光波长的激光即可，而且激发光的波长越小效果越好，所以，常规使用的488nm激光器就可激发上述8种QD，而408nm紫激光器激发的效果要比488nm激光器好。

与常规使用的有机荧光素相比，QD无机荧光素具有以下几个优点：①QD对于激发光的波长要求低，只要低于其发射荧光波长的激光都可以激发，所以多色分析时不需配备多个激光器，一个激光器就可激发所有8种QD；②QD发射的荧光信号很集中，波长范围较窄，其信号基本都能被对应的接收通道接收，很少会被相邻的非接收通道接收，所以使用QD时荧光通道之间的补偿很小；③QD发射的荧光信号与常规的有机荧光素发射的荧光信号波长范围基本不会交叉，所以QD基本不会与常规有机荧光素共用荧光通道，可以较为理想地与各种常规有机荧光素同时使用，进行多色流式分析；④QD化学性质更为稳定，不易被各种酶降解，其发射荧光信号的能力也很稳定，很少发生光漂白。

荧光素偶联抗体

流式细胞术最常使用的是荧光素偶联抗体（fuorochrome-coupledantibody），由荧光素和抗体两部分组成，抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。单克隆抗体技术现在已经很成熟，而且单克隆抗体的特异性明显优于多克隆抗体，所以，现在使用的荧光素偶联抗体中的抗体一般都是单克隆抗体。

在标记样品细胞时，荧光素偶联抗体中的抗体能够与相应的抗原分子特异性结合，这时带有该抗原分子的细胞表面就结合有荧光素偶联抗体，其中的荧光素被相应激光激发后能够发射特定波长的荧光信号，荧光信号被相应荧光通道接收，根据接收到的荧光信号的强弱就可以判断该细胞表达相应抗原分子的情况。

样品封闭

标记样品细胞的荧光素偶联抗体多为单克隆抗体，少数也可能是多克隆抗体。但无论是单克隆抗体还是多克隆抗体，其基本结构都由两部分组成，即包含有特异性结合抗原位点的Fab段和相对保守的Fc段，如图A所示。抗体的特异性表现在Fab段，标记时利用Fab段的抗原结合位点与细胞上抗原分子特异性结合，如图B所示，从而标记并且相对量化细胞表达该抗原分子的情况。但是，有些细胞表面表达FcR（ Fc receptor，Fc受体），如巨噬细胞、DC、B淋巴细胞等，FcR可以与荧光素偶联抗体的Fc段结合，如图C所示。Fc与FcR的结合是相对非特异性的，与抗体种属和类别有关，一般情况下，同种属、同类抗体（如所有的鼠IgG抗体）的Fc段是相同的，所以该种属细胞上的所有该类Fc段的FcR（如与鼠1gG对应的FcγR）都可以与Fc段发生非特异性的结合。

Fab段与抗原的特异性结合和Fc段与FcR的非特异性结合本质完全不同，但是其表现出的结果却是相同的，都使细胞带上荧光素，被激光激发后都可以产生荧光信号，根据结果（荧光信号）分析，流式无法区分该荧光信号代表的是特异性结合还是非特异性结合，即该细胞表达特异性抗原分子或者仅仅是表达FcR。

应用荧光素偶联抗体标记样品细胞，目标是检测Fab段与抗原分子的特异性结合，Fc段与FcR的非特异性结合是混杂信号，会导致流式分析结果错误，所以需要消除这种非特异性结合的影响。消除的方法就是在用荧光素偶联抗体标记样品细胞前先“封闭”样品。考虑到目前常用的荧光素偶联抗体基本都是IgG抗体，所以可以用无关IgG抗体先与样品细胞孵育一段时间，使样品细胞上的所有FcR都与无关IgG抗体的Fc段非特异结合，然后再标记荧光素偶联抗体，这时样品细胞上的FcR都已饱和，无法与荧光素偶联抗体的Fc段结合，如图D所示，也就“封闭”了与荧光素偶联抗体的非特异性结合，保证所有的结合都是抗原与荧光素偶联抗体的特异性结合。

样品封闭主要有以下两种方法：

样品封闭方法一

取适量的血清全IgG抗体与样品细胞充分混匀，4℃静置15min。

研究小鼠来源细胞时，若荧光素偶联抗体来源于大鼠，封闭采用大鼠血清全IgG抗体：研究人的细胞时，若荧光素偶联抗体来源于小鼠，封闭采用小鼠血清全IgG抗体。原则是，如果流式抗体可能与样品细胞的FcR发生非特异性结合，那么在标记荧光素偶联抗体之前先用流式抗体同源的全IgG抗体进行封闭，使样品细胞表面的FcR饱和。

样品封闭方法二

适量的抗CD16和抗CD32单克隆抗体与样品细胞充分混匀，4℃静置15min。

CD16（FcγRIII）是一种FcR，能够与IgG的Fc段结合，亲和力较强；CD32（FcγRⅡ）也是一种FcR，能够与IgG的Fc段结合，亲和力中等。而荧光素偶联抗体基本上是IgG抗体，所以在标记荧光素偶联抗体前可以用抗CD16和抗CD32单克隆抗体封闭样品细胞，使样品细胞表面的FcR都被抗CD16或抗CD32单克隆抗体结合，从而阻止后续荧光素偶联抗体与FcR的非特异性结合。

标记荧光素偶联抗体之前封闭样品细胞是一个好的习惯，能够避免因为非特异性结合产生的错误结果。但是，并不是标记荧光素偶联抗体之前必须封闭样品，并不是不封闭样品肯定会产生非特异性结合导致错误结果。一般样品细胞与流式抗体的种属来源是不同的，如标记小鼠来源的样品细胞的荧光素偶联抗体一般来源于大鼠、标记人的细胞的荧光素偶联抗体一般来源于小鼠。小鼠细胞的FcR不一定能够与大鼠来源的荧光素偶联抗体的Fc段结合、人细胞的FcR也不一定能够与小鼠来源的荧光素偶联抗体的Fc段结合，但是，也有可能因为种属关系较近，或者在一定环境条件下这种不同种属间的Fc段和FcR也能结合，实验者很难判断实验过程中这种结合是否会发生，但是在标记荧光素偶联抗体前封闭样品却可以保证这种非特异性结合一定不会发生。所以，实验者最好养成封闭样品的习惯。

荧光素偶联抗体标记

样品细胞标记荧光素偶联抗体的方法比较简单，只需在样品单细胞悬液中加入适量的荧光素偶联抗体，充分混匀，于4℃静置30min，然后用PBS洗去游离的抗体，流式PBS重悬细胞后就可上样分析。

标记荧光素偶联抗体时，可以适当减少样品细胞的体积以节省抗体。流式分析时需要的样品细胞数较少，5×10的5次方到1×10的6次方细胞就足够了，所以一般一份样品细胞的体积可以在10-100ul，如果目标细胞的比例不是很低，10ul的体积就已经足够了。因为在流式标记时，只需保证样品细胞中荧光素偶联抗体达到一定的浓度，保证荧光素偶联抗体相对过剩，就能保证样品细胞上的所有抗原分子都能与荧光素偶联抗体结合。所以每一份样品细胞的体积越小，每一份所需要加入的荧光素偶联抗体的量就会越少，就可以节约抗体，从而节约实验成本。流式分选时，分选的样品细胞量较多，这时样品细胞的体积也会相应增加，当然

其原则也是在保证标记质量的前提下尽量减少样品细胞的体积从而节约荧光素偶联抗体。

荧光素偶联抗体标记主要有两种方法：直接标记法和间接标记法，如图所示。

直接标记法就是直接用荧光素偶联抗体标记样品细胞，抗体直接与样品细胞上的抗原分子结合，与抗体直接偶联的荧光素作为指示剂间接反映样品细胞表达相应抗原分子的情况。直接标记法只需一步标记即可，方法简单，非特异性染色少，是常用的标记方法，如图所示。

间接标记法由两步标记组成，第一步用生物素（biotin）偶联抗体标记样品细胞，第二步用荧光素偶联链霉亲和素（streptavidin，SA）标记样品细胞，如图所示。间接标记法采用的是生物素－亲和素系统，该系统是20世纪70年代后期发展起来的一种生物反应放大系统，1分子亲和素可以与4分子生物素发生特异性结合，生物素和亲和素之间的结合虽然不是抗原-抗体性质的结合，但是两者结合的特异性、敏感性和结合力均不弱于抗原抗体之间的结合，在生物学中应用广泛。SA是与亲和素具有相似性质的一种蛋白质，因从链霉菌中提取而得名，SA等电点比亲和素低，且不含有糖基链，故在检测中的灵敏度和特异性都高于亲和素。

间接标记法一般在多通道分析需要通道搭配以减少荧光素偶联抗体的种类时使用。例如，进行4色（FTC、PE、Percp、APC）分析时，实验需要分析另外一种表面抗原分子（如CTLA-4），但是实验室没有荧光素偶联抗CTLA-4单抗，需要去购买，而根据已有的其他抗体和实验要求可能同时需要FTC偶联抗CTLA-4单抗、PE偶联抗CTLA-4单抗、Percp偶联抗CTLA-4单抗、APC偶联抗CTLA-4单抗4种抗体。在这种情况下，如果实验室已有SA-FITC、SA-PE、SA-Percp和SA-APC（间接标记法第二步标记的荧光素偶联SA是通用的），就只需要购买生物素偶联CTLA-4这一种抗体就可以了。此时，应用间接标记法就可以实现购买1种抗体同时适用于4通道分析的要求，从而节约实验成本。同理，如果实验要求检测样品细胞CD25抗原分子的表达情况，而分配给CD25的荧光通道并不确定，这时只需购买生物素偶联抗CD25单抗1种抗体应用间接标记法就可以满足实验要求；如果用直接标记法，就需要同时购买FITC偶联抗CD25单抗，PE偶联抗CD25单抗，Percp偶联抗CD25单抗，APC偶联抗CD25单抗四种抗体才能满足实验需求。

但是，当单色分析、多色分析不需要相互通道搭配，或者相应荧光素偶联抗体的通道分配很眀确时尽量用直接标记法，因为直接标记法方法简单，只需一步标记即可，而且结果明确。直接标记法和间接标记法比较见表。

来源：张小坑 医学科研小坑