介绍一篇发表在Journal of the American Chemical Society上的文章，标题是“Site-Specific Covalent Labeling of DNA Substrates by an RNA Transglycosylase”，通讯作者是加州大学圣迭戈分校的Neal Devaraj教授。Neal教授的主要研究方向是人工细胞膜，生物正交反应和RNA检测标记。在本文中，作者通过对TGT酶的机理分析与底物序列的筛选优化，实现了对单链DNA底物的位点特异性共价标记，并应用于RNA印迹和RNA荧光原位杂交。

修饰寡核苷酸作为常用的探针被广泛应用在成像，诊断和制药等方面。目前修饰核酸的掺入往往是通过在固相合成中通过磷酰胺化学实现，以及，一系列依赖于化学或酶法进行碱基、糖环骨架的修饰。酶法能在温和的水相环境中完成高效准确的修饰，在生物体系中较为友好。在常见核酸类型中，DNA的脱氧核糖骨架较RNA稳定，被广泛应用于生物技术中。对DNA的修饰包括使用TdT在3‘引入修饰碱基，在5’引入修饰磷酸等。但目前基于酶的小分子修饰ssDNA方法报道很有限，如果能实现这一目的则可应用于诊断，治疗，材料科学，成像，DNA编码等领域中。

在此之前，该组已实现了利用细菌来源的tRNA鸟嘌呤转糖基酶（TGT）进行RNA的特定位点标记。TGT酶能催化tRNA反密码子loop区特定位置鸟嘌呤和7-脱氮鸟嘌呤衍生物发生交换。此外已被证明的是，完整的RNA结构对TGT酶活性来说并不是必需的，其最小识别单元为17-nt的发夹结构ECY-A1（tRNA^Tyr的loop区）。基于此，作者开发了RNA-TAG，即TGT酶识别最小的loop结构并结合到感兴趣的RNA中，催化目标G碱基与天然preQ1底物的合成衍生物交换，这些衍生物可以与功能基团如荧光团或亲和配体结合完成标记。作者此前已经证明了RNA-TAG在一系列应用中的实用性，包括用于蛋白质组学研究的RNA生物素化，控制mRNA翻译以及细胞中光激活的CRISPR基因编辑等。作者尝试扩展RNA-TAG体系到DNA将以此实现ssDNA的一步，位点特异性标记修饰（图1）。

通过机理分析，TGT酶将G交换为preQ1的过程在电荷上依赖于G碱基和核糖主干的环氧，这表明DNA底物上缺乏2-OH不会损害TGT的识别或活性。然而，之前的研究认为TGT酶不能作用于未修饰的DNA底物，并提出为了有效识别，需要热力学更稳定的额外4碱基配对作为延伸茎部迷你螺旋(dECYMH模序)且需要进行非天然的核碱基替换(T→dU)才能实现。

根据目前的结论，作者验证TGT酶发现其确实能对dECYMH进行少量的修饰（＜5%），因此认为TGT酶直接对ssDNA进行修饰是有希望的（图2）。通过不断缩减T→dU数量，缩减到仅替换“UGU”识别部分外加4碱基茎环延长发夹序列dECYMH：GGGAGCAGAC XGX AAATCTGCTCCC，并通过偶联biotin成功后的凝胶迁移实验进行验证。为了验证到底是什么因素抑制了TGT酶活性，作者合成了全5-meU（rT）替换的dECYMH模序，并发现该模序以近乎wt RNA发夹的效率被修饰，证明TGT酶对于T碱基是容忍的。作者认为TGT酶对于ssDNA不耐受是由于脱氧核糖骨架和T碱基上甲基位阻所共同导致的。基于以上的结论，作者认为使用替代性的DNA底物可以实现TGT酶标记。

以往对TGT酶的研究主要针对17nt的ECY-A1或25nt的ECYMH，其中的4种反密码子GUN分别对应Tyr，His，Asp和Asn，但它们的最小识别基序都是UGU，即TGT酶并不能进行区分。作者分别将这4种17nt的发夹序列命名为dECY-0，dECH-0，dECD-0，dECN-0，并分别探究TGT酶对其修饰效率。作者发现TGT酶对dECH-0或dECD-0活性相对于dECY-0从5%提高到40%，相反dECY-0则更倾向于降解。作者在这里并没有进一步讨论，但认为40%的修饰效率相比于RNA-TAG仍不算高。作者接下来试图确定每个tRNA发夹的stem/loop的重要性。作者设计了复合底物，交换了所有四种同源DNA类似物的stem和loop。所有带有天冬氨酸stem(dECD)的底物标记效率均超过40%，His-stem-Asp-loop底物的标记率超过50% (dECH)，因此认为stem/loop序列对TGT酶修饰效率影响很大。

因此作者进一步设计了9个发夹突变体，通过实验结果进一步设计了31个突变体，最终得到能被TGT酶有效识别的YTGTCCY/YTGTYCC序列，由于Y代表体积更小的嘧啶碱基，这肯定了之前结论中认为底物位阻占主要作用的观点。其中TTGTCCT loop序列标记效率最高，即使用17-nt序列也能被TGT酶在4h内标记95%以上。

RNA-TAG的一大优势在于具有广泛的底物容忍性，因此作者验证了TGT酶/dECH-10对一系列衍生物的容忍度，包括biotin，TAMARA，Cy5，AF647，AF488，硅基罗丹明，发现均保留较高的修饰效率。此外，无论是dECH-10序列位于59 mer ssDNA的5‘，3’或中部均能被修饰, 也能在ssDNA上实现多个识别序列的同时修饰。

作者又将DNA-TAG应用于RNA的单分子荧光原位杂交（smFISH），将从IDT公司购买的普通核酸探针与TGT酶，preQ1-TAMARA反应，通过简单的过滤纯化制得了smFISH荧光探针，并与lncRNA MALAT1杂交。将制得探针和正交的商业化探针(标记为Stellaris)组合使用，发现两种探针具有相同的点状染色质定位。单标记探针组的信号足以可靠地检测MALAT1，双标记探针的信号并没有显著改善，这可能是由于TAMRA的自淬灭，因此在smFISH中使用该技术时，应考虑TAG发夹的额外体积和探针之间的间距（图4）。

本文作者：MY

原文引用：https://doi.org/10.1021/jacs.3c00861

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