今天给大家分享的文献发表在Nucleic Acids Research上，标题为Chemoenzymatic labeling of DNA methylation patterns for single-molecule epigenetic mapping，通讯作者是以色列特拉维夫大学的Yuval Ebenstein教授。

DNA甲基化，特别是胞嘧啶（C）核苷酸在5-碳位置的甲基化（5mdC），是研究最多和最重要的表观遗传修饰。甲基化是由不同的甲基转移酶（MTases）家族建立的。这些酶利用S-腺苷-L-蛋氨酸（AdoMet）作为甲基供体，形成甲基化的DNA和副产物S-腺苷-L-高半胱氨酸（AdoHcy）。

目前，已有多种方法在碱基对分辨率下特异性分析全基因组5mdC。金标准技术是亚硫酸氢盐测序（BS-seq），然而，这种方法可能会受到一些限制，如较高的DNA降解和由于扩增过程而导致的潜在偏差。单细胞亚硫酸氢盐测序可以分析单个甲基组，但在表征大可变和重复区域方面仍然有限。单分子实时测序（SMRT）和纳米孔测序的第三代测序方法能够直接检测5mdC，但是进行全甲基组分析成本高昂。通过光学基因组图谱（Bionano Genomics Inc.）进行的全基因组表观遗传学分析是表观遗传图谱工具箱的新成员。该技术基于拉伸长基因组DNA片段进行光学成像，可输出极长的单分子数据（N50-200 kb），DNA用两种颜色标记，一种用于将分子与参考基因组对齐，另一种用于报告分子的表观遗传内容，可以分析大的可变和重复区域。

作者提出了一种化学酶标记方法，用于检测所有非甲基化CpG，作为全基因组甲基化定量和基因组甲基化图谱的手段。该方法利用来自细菌螺旋体属菌株MQ-1的CpG特异性MTase M.SssI来实现，该酶将甲基转移到CpG二核苷酸中胞嘧啶的第5位。虽然M.SssI有可能标记所有非甲基化的CpG，但它不能利用修饰的AdoMet辅因子。而M.SssI的工程变体（Q370A/N6A，eM.SssI）能够通过处理叠氮化物修饰的辅因子AdoYnAzide （Ado-6-azide），将叠氮化物基团转移到非甲基化的CpG位点。不过，链霉亲和素修饰磁珠的亲和捕获仅显示出20-30%的捕获效率，表明标记产量低。这可能是因为在eM.SssI的DNA烷基化过程中，辅因子副产物AdoHcy可以通过占据辅因子结合口袋并阻止额外的烷基化循环来降低整体DNA烷基化效率（图1A）。为提高标记效率，作者采用了酶3-甲硫腺苷/S-腺苷同型半胱氨酸核苷酶（MTAN），该酶催化糖苷键的水解，可降解非活性辅因子副产物AdoHcy。结果显示，在反应中加入 MTAN 后，AdoHcy浓度降低，平均标记强度增加了两倍（图1C），有效推动反应向标记效率增加的方向发展。

之后在叠氮化物-炔烃环加成反应（SPAAC，无铜点击化学反应）中，叠氮化物修饰的DNA可以被二苯并环辛炔-cy5（DBCO-cy5）荧光团共价标记，以特异性标记非甲基化的CpG位点。因此，eM.SssI/MTAN 组合增加的效率被用于生成光学图谱，以单分子灵敏性呈现 CpG 位点的全基因组表观遗传状态。

图1 化学酶标记法的基本原理示意图

作者使用该方法量化了慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者和健康供体的人外周血单核细胞（PBMC）的全基因组甲基化水平。在纳米通道阵列芯片中拉伸健康和患者DNA，成像，并检测来自非甲基化CpG标记的荧光（图2A）。通过沿着DNA分子的整体红色强度总和（即CpG环境中的非甲基化胞嘧啶）来反映相对的整体甲基化水平，归一化为每个样品测量的总DNA长度，与健康对照相比，癌细胞显示出甲基化水平的整体降低（图2B）。

图2  健康和CLL患者供体PBMC中的甲基化定量结果

接下来，作者在模式植物拟南芥的基因组中绘制CpG甲基化谱。该基因组由五条染色体组成，总大小约为135 Mb。在拟南芥中，DNA甲基化通常发生在所有序列环境中（CG、CHG和CHH，其中H = A，T或C），转座子、重复序列及一些蛋白质编码基因的甲基化与基因沉默和基因组稳定性有关。提取拟南芥DNA，使用eM.SssI/MTA法标记非甲基化CpGs，并使用切口酶在DNA标记上含有用于测序的特定条形码序列。

然后通过电动力学将双标记的DNA分子强行进入纳米通道并在Bionano Genomics（Inc）Irys系统上成像，从而可以通过检测荧光标记信号获得DNA序列信息（图3A、B）。通过该方法，作者对拟南芥基因组进行了检测，共检测到34866个长度超过100 kb的DNA分子，其中28917个可以比对到TAIR10拟南芥参考基因组上，单位点的平均测序深度为47×，基因组覆盖率约为97%。通过Irys Extract创建每个分子的表观遗传标记的强度曲线，然后计算与同一区域对齐的所有分子的标准化平均强度（图3C）。

图3 光学甲基化映射示意图

为了进一步评估表观遗传光学映射甲基化图谱，作者计算了其同公开可用的亚硫酸氢盐测序数据的全基因组相关性。将全基因组亚硫酸氢盐测序数据呈现为CpG的非甲基化部分。为了克服两种方法之间的缩放和分辨率差异，作者将来自亚硫酸氢盐测序数据的每个非甲基化CpG填充±500 bp，并在10 kb的bin中对整个基因组进行汇总，以产生对应于每个bin中非甲基化CpG位点数量“甲基化评分”（分数越高，非甲基化CpG位点越多），然后将该数据与光学表观基因组图谱的平均强度分布进行比较。首先，将局部强度的总和除以局部覆盖率来对光学数据进归一化，以获得整个基因组中1 kb bin中的荧光强度评分。然后将每个bin中的归一化强度分数除以全局最大强度，将相对强度数据设置在 0–1 之间。光学映射数据与全基因组亚硫酸氢盐测序数据密切相关（图4A，Spearman相关系数为0.745）。

拟南芥基因组的全基因组非甲基化CpG位点水平说明了光学映射与全基因组亚硫酸氢盐测序数据之间的相关性（图4B）。拟南芥基因组的着丝粒富含甲基化的CpG，因此在着丝粒位置的光学图谱显示为凹陷（低信号表示高甲基化，图4B）。图4B的下图显示了一个放大区域，说明了两种方法之间的正相关关系。蓝色轨道中更精细的细节突出显示了全基因组亚硫酸氢盐测序数据的更高分辨率。然而，通过光学映射观察到的长分子（>100 kb），作者获得了拟南芥基因组可靠且高度连续的表观遗传图谱。

图4 甲基化光图谱与全基因组亚硫酸氢盐测序整体相关性

综上，作者开发了一种基于化学酶标记和光学映射检测基因组非甲基化的方法，进一步证明了模式植物拟南芥的全基因组甲基化图谱。该方法允许在单分子水平上同时对长段DNA进行遗传和表观遗传学表征，并可能允许研究单个细胞之间的变异。

文章编号：172

原文链接：

https://doi.org/10.1093/nar/gkac460

原文引用：

Tslil Gabrieli, Yael Michaeli, Sigal Avraham, Dmitry Torchinsky, Sapir Margalit, Leonie Schütz, Matyas Juhasz, Ceyda Coruh, Nissim Arbib, Zhaohui Sunny Zhou, Julie A Law, Elmar Weinhold*, Yuval Ebenstein*. Chemoenzymatic labeling of DNA methylation patterns for single-molecule epigenetic mapping. Nucleic Acids Res, 2022, 50, e92.