大家介绍一篇最近发表在PNAS上的文章，题目为“A genetically encoded photoproximity labeling approach for mapping protein territories”。本文的通讯作者是普林斯顿大学的Tom muir，专注于通过将合成有机和物理化学工具与分子遗传学工具相结合来研究蛋白质功能。
蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）在调节细胞功能方面起着关键作用，现有的用于研究PPI的邻近标记方法主要包括酶催化以及光催化，邻近标记酶可分为两个家族——生物素连接酶和过氧化物酶。生物素连接酶的时间分辨率较差，而过氧化物酶需要引入H2O2，对细胞毒性较大。光邻近标记方法，这种方法依赖于将化学光催化剂递送到特定的细胞位点。去年NCB发表的PhoTAG就是采用给抗体偶联光敏剂的方法将光敏剂靶向特定细胞部位，而陈鹏课题组则是采用mgSART酶将光敏剂偶联到特定细胞表面。
本文主要开发了一种基因编码工程化LOV*结构域的光邻近标记的方法。作者利用蓝光下，LOV*结构域结合辅因子FMN，发生构像变化，FMN激发成三重态参与单电子转移SET反应，生成探针中间体标记临近蛋白。该方法称为LITag。作者在293细胞中表达工程LOV*结构域融合的组蛋白H2B，然后用生物素-苯酚BP探针处理细胞并用蓝光照射。只需1秒的照射即可检测到细胞蛋白的标记，没有光照的地方无法发生物素标记，说明该方法具有较好的空间控制，且毒性较低。除了BP探针，作者还尝试了BA探针，BA探针的标记效率虽然比BP探针强，但是由于BA探针的生物素标记是LOV*非依赖性的，所以在没有特别说明的条件下，本文使用的探针是指BP探针。作者将LOV*融合表达在活细胞的不同细胞器，将细胞与BP孵育并照射1至3秒来进行进行光催化临近标记。BP的核仁标记效果较差，于是采用BA用于核仁标记。作者研究光催化LOV*邻近标记的分子机制。他们设想了两种可能的反应途径，都源于FMN辅因子的三重激发态。首先，高氧化性三重态激发的FMN可以通过 SET 与 BP 或 BA 反应，产生自由基中间体标记酪氨酸等。另一种，可以通过能量转移产生单线态氧，单线态氧氧化组氨酸与探针反应。为了验证这些假设，作者将LOV*融合表达磷酸化酶B和牛血清白蛋白跟BP或BA体外标记，LC-MS/MS分析，BA可以标记多肽上的两种氨基酸，而BP显示出强大的酪氨酸修饰，并且仅微弱地标记组氨酸。光激发光敏剂的临近标记，基于SET和基于单线态氧的机制都是可操作的，具体取决于所用探针的性质。3.LITag用于定量蛋白质组研究蛋白蛋白相互作用作者用LOV*融合表达线粒体靶向序列，用BP孵育细胞30分钟后不同时间蓝光照射，confocol显示LOV*的精准定位，wb显示标记几秒开始。用SILAC定量鉴定出富集的160多种线粒体定位蛋白。可能是由于自由基的膜不透性原因，作者发现只有基质或线粒体内膜（IMM）中的蛋白质会被标记。作者发现光催化的LOV*融合线粒体系统也可用于富集线粒体RNA。图5. LITag用于定量蛋白质组研究蛋白蛋白相互作用进一步，作者在U2OS中将LOV*融合表达PARP1，微波诱导的DNA损伤的募集LOV*融合PARP1蛋白。通过H2O2诱导损伤，30minBP孵育后1s蓝光wb显示标记，SILAC定量识别到的99个targets大多数是PAR binder、PAR修饰靶标或两者兼有，作者还观察到富集蛋白质中有54个红色的是在DNA损伤反应中的广泛参与的RNA结合蛋白。作者对HMGB1的高富集特别感兴趣，HMGB1是一种多功能染色质相关蛋白，参与各种DNA修复途径。想知道HMGB1的招募是否跟PAR的合成有关，U2OS细胞中的激光微照射实验，用PARP1抑制剂处理显著减少了HMGB1的积累，表明了DNA损伤位点PAR修饰募集HMGB1，表明LITag可用于在动态细胞过程（如DNA损伤）中捕获邻近蛋白。图6. LITag用于研究DNA损伤等细胞快速过程作者接下来应用该策略表征了MVP蛋白的相互作用组分，MVP是拱顶粒子的主要组成成分，与多种细胞过程有关，通常与细胞凋亡抵抗有关。作者在Hela细胞中将LOV*融合到MVP的N或C末端，差速离心显示，N-末端标记的MVP有效地结合成拱顶颗粒，而C-末端标记的MVP则没有。表达LOV*-MPV的细胞与含生物素的BA探针一起孵育，并照射3秒，观察到强大的蛋白质标记，而使用BP探针提供较弱的蛋白质标记。SILAC定量富集了78种蛋白质被鉴定为潜在的MVP相互作用靶标，包括PARP4，已知是拱顶颗粒的组成成分，除此之外，许多富集的蛋白质与核转运有关，验证之前文献报道的拱顶粒子参与核转运过程。还有一些调节蛋白质折叠的分子伴侣蛋白HSP70，作者想研究HSP70是与整个拱顶颗粒相互作用，还是与MVP单体相互作用，使用梯度离心从可溶性HeLa裂解物中分离出拱顶颗粒。Wb显示，BAG2与拱顶颗粒蛋白MVP和PARP4共沉淀，BAG2是HSP70的核苷酸交换因子。LITag方法与大分子颗粒兼容，因此，可能在类似系统的研究中有用，例如在感染细胞中组装病毒衣壳。原文链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2219339120原文引用：https://doi.org/10.1073/pnas.2219339120
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