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给大家推荐一篇发表在Anal. Chem.上的文章，文章标题是Bioorthogonal Chemical Labeling Probes Targeting Sialic Acid Isomers for N-Glycan MALDI Imaging Mass Spectrometry of Tissues, Cells, and Biofluids。其通讯作者是南卡罗莱纳医科大学药学院的Richard R. Drake教授。课题组主要工作包括临床组织N-聚糖的质谱成像、癌症糖组学标志物的发现和复杂聚糖分析方法的开发。
作为糖缀合物的一部分，唾液酸具有许多生物学功能，是碳水化合物肿瘤抗原的常见组成部分。质谱成像是一种常用的研究唾液酸的方法，但由于唾液酸不稳定的性质，MALDI和ESI都会导致唾液酸部分损失。已有多种化学修饰策略对唾液酸进行衍生化从而使其稳定，作者基于常见的衍生化方法——amidation–amidation（AA）策略，结合生物正交化学技术，实现了α2,3和α2,6唾液酸化N-糖异构体的区分。 首先，作者在体外验证了这一方法的可行性。如图1所示，第一步引入2-氨基苯甲酸酯（2AB）基团，用于检测和纯化。第二步通过EDC、HOBT和二甲胺进行衍生化，该反应使α2,3连接的唾液酸形成内酯，α2,6连接的唾液酸的羧基发生二甲酰胺化。第三步，通过炔丙胺或者叠氮基-PEG4-NH2进行第二次酰胺化，分别称为AAXL和AAN3方法。最后，通过CuAAC反应，得到偶联了生物素的唾液酸化乳糖。 图1. AAXL和AAN3的反应方案。
为了测试AAXL和AAN3方法的适用性，作者在前列腺癌组织对单唾液酸化的双天线N-糖（Hex5HexNAc4NeuAc1）进行了检测，结果如图2所示。 未衍生化的组织（图2A）， 在m/z=1954.6768出现了峰，是Hex5HexNAc4NeuAc1，即α2,3和α2,6异构体的混合。AA反应处理的组织（图2B），在m/z=1953.6948处出现了一个峰，相比于Hex5HexNAc4NeuAc1，质量偏移了-0.9840 Da，代表形成内酯的α2,3连接异构体，m/z=1981.7241处的峰则代表二甲酰胺化的α2,6连接异构体。但是，AA衍生化的α2,3唾液酸化峰表现出非标准同位素分布模式，+1和+2同位素处的信号增加，作者认为， m/z1954.6768为未充分衍生化的同位素峰，m/z1955.6972则为双岩藻糖基化的Hex5dHex2HexNAc4，这两者之间发生了重叠，从而导致同位素峰的分布模式变化。 在AAXL处理的组织中（图2C），m/z=1991.7104对应于炔丙胺化的α2,3异构体，而m/z=1981.7241则与AA一样，代表二甲酰胺化α2,6异构体。这一结果表明，AAXL可以避免AA处理导致的重叠峰，因为在该质量范围内，其同位素分布中没有已知的聚糖。AAN3处理的组织中（图2D），同样避免了同位素重叠，叠氮化物标记的α2,3连接异构体出现在m/z=2154.8061，质量偏移与预期一致。但是，相对于AAXL，α2,3衍生化异构体在AAN3中总信号强度较低，且较大的质量偏移会限制其对更大质量的多唾液酸化N-糖的检测。
图2. 确定AAXL和AAN3在N-糖质谱成像上的适用性。
为了确定AAXL修饰对稳定唾液酸的有效性，对具有较大质量的多唾液酸化N-糖进行了检测。在图3A，B中突出显示了肿瘤区域，双唾液酸化的三天线N-糖Hex6dHex1HexNAc5NeuAc2的所有异构体组合如图3 C–E所示，并叠加在图3 F中。图3G–K代表了同一聚糖（Hex6dHex1HexNAc5）发生三种不同唾液酸化后的异构体，可以看出，这些聚糖具有相似但不重叠的分布模式，表明α2,3和α2,6唾液酸在不同组织区域存在区室化现象。这一结果证明了AAXL在分析多唾液酸化聚糖方面的可行性和有效性，这是传统的质谱成像方法通常难以检测和区分的。
图3. 通过AAXL衍生化后检测多唾液酸化N-糖。
接下来，作者对四种胰腺癌细胞系（PANC1，ASPC1，HPAC，PL45）进行了AAXL衍生化，这些细胞系可以表达CA19-9等碳水化合物肿瘤抗原。实验流程如图4A所示，在具有MALDI兼容的阵列载玻片中培养四种细胞系，每孔一万个细胞粘附过夜，固定在福尔马林中。然后将固定细胞在PBS中短暂洗涤，最后通过AAXL进行衍生化。 图4B、C分别对应α2,6（m/z=2127.7820）和α2,3（m/z=2137.7663）唾液酸化聚糖，AAXL发现这些聚糖异构体在所分析的细胞系之间存在可量化的表达差异（图4D）。此外，通过主成分分析（PCA）（图4E），评估了四种细胞系的N-糖组之间的差异和相似性。对于未衍生化的细胞系，其PCA分析聚集成定义较少且重叠较多的簇。相比之下，AAXL衍生化的N-糖的PCA分析，可以得到特定于每个细胞系的离散簇。
图4. AAXL与N-糖质谱成像结合对培养细胞进行糖分析。
最后， 作者评估了衍生化α2,3连接的唾液酸的生物素化能力，以用于基于链霉亲和素的染色方法。将两种方法处理的组织，通过CuAAC反应引入生物素，再用链霉亲和素-HRP处理，最后用DAB染色。结果显示，AAXL生物素化组织的染色最小（图5A），而AAN3生物素化的组织染色更强。作为对照，在不存在铜催化剂的条件下进行了AAN3染色，在该对照组织中未观察到DAB染色。同时，也做了唾液酸酶处理组织的对照，很少或没有DAB染色，表明用AAN3对FFPE组织进行载玻片处理与非唾液酸化靶标几乎没有反应。
图5. AAXL 和 AAN3在免疫组织化学上的应用。
总的来说，作者开发了一种靶向唾液酸异构体的质谱成像方法，可以与临床组织、生物流体和培养细胞兼容，为唾液酸异构体的靶向标记、检测和可视化提供了新方法。 文章作者：CXY DOI：10.1021/acs.analchem.2c04882 责任编辑：LD
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