目前，NIR荧光探针通常被用于可视化和了解细胞内的活动。自标记蛋白标签与合成荧光探针的结合是化学生物学中最有前途的研究领域之一。事实上，目前，蛋白质标记技术不仅用于监测蛋白质的动态和定位，而且在成像应用中发挥着更多样化的作用。例如，对蛋白质活性和调控进行可视化的主要技术之一是基于蛋白质标签及其相关的NIR荧光探针。这篇综述主要讨论了用于各种蛋白质标签系统的几种NIR荧光探针的发展。

最近，为了克服可见范围荧光团的局限性，近红外(NIR)荧光团被开发，以减少背景荧光信号，并可视化深层组织（图1）。蛋白质的动力学和功能的活细胞成像是发现蛋白质在细胞活动中的新作用的一个关键研究领域。特别是，荧光蛋白(FPs)被广泛用于荧光显微镜来监测融合蛋白的定位和动态。然而，FPs在荧光成像中的使用的局限性是由于低光稳定性和亮度，这阻碍了FPs在高分辨率成像技术中的应用。因此，为了提高FPs的光稳定性和亮度，人们进行了各种改进。

图1 常用荧光团的发射区域和化学结构

另外，由于具有良好光物理性质的小分子荧光探针易于调谐，因此利用合成荧光探针的自标记蛋白标签是一种有利的策略(图2)。在这种技术中，将蛋白质标签融合到感兴趣的蛋白质上，并使用合成的荧光探针进行选择性标记，提供蛋白质定位的荧光图像。与FPs相比，使用蛋白质标签的一个显著优点是它们可能应用于脉冲酶实验，其中荧光探针可以在特定时间点标记一个蛋白质。此外，合成探针的高光稳定性和颜色变异性使蛋白质标记技术成为FPs的合适替代方法。迄今为止，已经开发出各种具有高光稳定性和亮度的NIR荧光探针，用于标记蛋白质标签，为脉冲追逐成像、多色成像、单分子成像和超分辨率成像提供化学工具。下文将分别列出。

图2 用化学探针表示自标记蛋白标签的示意图

（1）基于SNAP - tag和CLIP - tag的系统

SNAP-tag是从人O6 -烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶( hAGT )的突变版本中开发的一种自标记蛋白标签( 19.4kDa )，是一种DNA修复蛋白。半胱氨酸145是一种活性氨基酸，通过双分子亲核取代反应反应将烷基鸟嘌呤底物的O6转移(图3A)。此外，CLIP - tag是一种基于AGT的标签，能与O2 -苄基胞嘧啶( BC )衍生物发生特异性反应。这些标签的不同特性使得同时标记两种不同的蛋白质成为可能。利用与BG、BC相连的Cy5支架，或者两者结合SNAP-tag、CLIP-tag，或者两者结合(图3B )，制备了SC- Cy5和SS- Cy5近红外荧光探针，可在细胞裂解液中选择性交联蛋白质，用于研究蛋白质相互作用。鉴于近红外荧光探针的优点，Song等人利用近红外荧光团开发了SNAP - tag探针PYBG - D (图3C )。有趣的是，该探针对细胞膜具有通透性，能够特异性地标记融合在细胞核SNAP标签上的组蛋白2B (图3D )。该探针也被用于线粒体蛋白的成像，这表明该探针可以作为揭示线粒体蛋白功能障碍或易位的潜在工具。

图3

（2）基于Halo - tag的系统

Halo-tag是细菌酶卤烷脱氢酶的突变体，其中组氨酸272被苯丙氨酸取代。其天冬氨酸106是一种活性残基，在与卤代烷烃发生双分子亲核取代反应反应时形成酯键(图5A)。图5B呈现了各种基于Halo-tag的近红外荧光探针。为了扩大活细胞中自闪烁的荧光团的颜色范围，Morozumi等分别开发了由碳吡喃和焦油硅组成的绿色和近红外荧光团CP550和SiP650。这些荧光团被设计成可逆反应的胞内谷胱甘肽亲核加成，导致活细胞发生荧光闪烁(图5C )。带有这些荧光团的HaloTag配体(  CP550 - Halo和 SiP650 - Halo )特异性标记b-tubulin- HaloTag融合蛋白并允许SMLM成像(图5D )。

图5

（3）基于PYP标签的系统

PYP-tag是一种来自紫色细菌的光活性黄色蛋白，是一种小的单体蛋白(14kDa)。它通过半胱氨酸69的反式硫酯阳离子反应与4-羟基肉桂酸或香豆素的硫酯衍生物结合，分离硫酚为离去基(图6A)。通过将二硝基苯( DNB )淬灭剂加入到与吩嗪母体ATTO655相连的4 -羟基肉桂酸配体中，建立了一种近红外荧光探针AT- DNB2，靶向PYP-tag (图6B )。荧光团分子内与DNB猝灭剂相互作用，使AT- DNB2在自由状态下发生荧光猝灭。AT-DNB2与PYP-tag共价结合，同时释放DNB猝灭剂，从而释放出16倍明亮的荧光。利用这些荧光探针，可观察到融合到PYP-tag上的葡萄糖转运蛋白4 ( GLUT4 )的细胞内转运。在胰岛素存在的情况下，GLUT4从细胞内的储存囊泡转移到质膜上(图6C)，并被保留在细胞膜上用于葡萄糖摄取。同时，胰岛素的去除促进了GLUT4的内化。

图6

（4）基于BL-tag的系统

BL-tag是通过修改β-内酰胺酶开发的一种自标记蛋白标签。BL-tag是TEM-1的突变体，其中166位的谷氨酸被谷氨酰胺取代，从而抑制脱酰步骤，而丝氨酸70作为活性残基(图7A)，与b-内酰胺环形成酯键。作者团队研制了一系列膜透性探针SiRcB ( n ) (  n= 2,4,6 ) (图7B )，其中SiR作为NIR的发色团，与青霉素前药美洛平偶联，作为BL-tag配体。使用这些工具，可以观察到来自细胞核的NIR荧光信号，表明探针可渗透到细胞膜内（图7C）。值得注意的是，通过修改低聚乙基氧连接体的长度来调节探针的亲水性和细胞通透性，对于标记的细胞内蛋白的单分子成像至关重要。

图7

(5)eDHFR / TMP-基于标签系统

与基于共价的蛋白质标记策略不同，非共价标记提供了一些优势，例如由于缺乏共价键形成的需要而标记非常快。Miller等人从大肠杆菌酶二氢叶酸还原酶(eDHFR)中开发了一种基于小分子的抑制剂标签。以三甲氧苄啶( TMP )偶联的荧光团为探针，对eDHFR标记的融合蛋白进行选择性标记(图8A )。此外，Wombacher等人利用eDHFR / TMP标签结合合成的近红外发光体实现了超分辨成像。他们利用ATTO655作为超分辨成像的理想荧光团，因为它在细胞条件降低的环境下具有高效的光控特性。为了生成共价结合的蛋白标签，将亮氨酸28替换为半胱氨酸的突变eDHFR / TMP-tag ( eDHFR：L28C )与TMP-荧光团结合物上引入的亲电丙烯酰胺反应(图8C)。此外还开发了一种化学探针A- TMP-ATTO655 (图8D )，用于共价标记eDHFR /TMP-tag的荧光团。用ATMP-ATTO655处理细胞核和质膜的HEK293T细胞(图8E)，通过共聚焦显微镜对靶蛋白进行了快速标记半衰期。

图8

（6）基于FAP-tag的系统

Szent - Gyorgyi等人建立了一个荧光团激活蛋白( FAP ) - tag系统，在该系统中，化学探针以暗态存在，当与报告基因结合时，荧光发射(图9A )。作者筛选了人单链可变片段( scFv )抗体库(大小< 30kDa )，并开发了与孔雀石绿( MG )结合的FAPs (图9B )。MG在缓冲液中是非荧光的，但当发色团与FAP结合时受到限制时，在NIR区域发出荧光。在表达scFv抗体的酵母细胞中进行荧光筛选后，MG-2p荧光发射增强，获得FAP表达克隆(图9C )。荧光团标记使MG 荧光团在FAP融合的细胞表面蛋白中产生较强的NIR荧光。有研究基于二甲基吲哚红( DIR )类似物研制了一种近红外化学探针(图9D )。探针对特异性克隆的K7 scFv表现出较高的结合亲和力。此外，作者还发现这些探针与K7的解离常数在nM范围内，与K7结合后量子产额增加。此外，作者还发现表达FAP K7的酵母可以通过DIR探针进行荧光检测(图9E )。

图9

(7)基于FAST-tag的系统

Plamont等人报告了一种荧光激活和吸收转移标签( FAST )，一种小的蛋白质标签，能够在活细胞中可逆地荧光标记含有荧光团的蛋白质。该蛋白标签是由单体小蛋白PYP的一个变体设计而成的。最近，Li等人描述了一种远红化学探针，HPAR-3OM，它针对远红FAST(frFAST)标签。frFAST标签是通过原始FAST标签的发色团结合位点的突变而开发出来的。探针HPAR-3OM最初在溶液中无荧光，但以115 nm斯托克斯位移结合到frFAST标记上时强烈发射荧光信号(图10)。这种HPAR-3OM标记系统允许在活细胞中对带有frFAST标记的各种融合蛋白进行高对比度的远红荧光成像。

图10