分享一篇最近在Chemical Science上发表的研究进展，题为：“One Stone Two Birds: b-Fluoropyrrolyl-Cysteine SNAr Chemistry Enabling Functional Porphyrin Bioconjugation”，该工作的通讯作者是来自北京大学化学与分子工程学院的张俊龙教授。该方法具有水相进行、快速反应（15分钟）、优异的化学选择性和广泛的底物范围，包括温和条件下的各种多肽和蛋白质。该偶联实现了卟啉的吸收红移到近红外区域（NIR，>700 nm），同时加速系间跨越，促进活性氧产生，为开发生物相容性的卟啉偶联物提供全新方案。图1. a）已报道的氟-半胱氨酸SNAr化学和反应位点（红色）。b）本工作开发的b-氟吡咯-半胱氨酸SNAr化学用于卟啉生物偶联。 生物偶联是一种通过共价连接生物分子赋予小分子生物相容性和靶向特异性的合成工具，有望成为下一代诊断或治疗的工具（Nat. Chem. 2016, 8, 103-113）。除了建立化学键之外，这种化学修饰还同时改变了小分子的物理化学性质，但在设计新的生物偶联物时很少受到重视。卟啉及其衍生物是久负盛名的光敏剂，与天然存在的光收集天线和氧化还原辅酶具有相似的四吡咯核，在功能材料、催化化学和生物医药领域有着广泛的应用。卟啉作为人工合成的大环化合物，通过生物偶联，以产生具有结构和功能多样性的理想类药分子。通过生物偶联，生物分子如寡核苷酸、肽、蛋白质、和糖已被用于增强卟啉的生物相容性和肿瘤特异性。其中，由于空间位阻小和芳基取代丰富，meso-芳基被选为主要的偶联位点（图1）。然而，meso-芳基垂直于四吡咯平面，在π-共轭和相关激发态中几乎不传递电子耦合。相比之下，b-吡咯环修饰可以方便、有效地调节卟啉的光物理性质，但由于b-位的空间位阻和反应惰性，尚未实现生物偶联。为了填补知识空白，该工作的目标是开发一类卟啉b-生物偶联的通用方法，同时实现卟啉的光物理性质调控。 硫原子，通常出现在半胱氨酸残基中，由于固有的高亲核性，在位点选择性翻译后修饰和生物偶联中起着重要作用。通过对亲电弹头（如马来酰亚胺）的合理设计，一种通常由半胱氨酸残基形成的新型C-S键在设计生物探针、小分子抑制剂、抗体-药物偶联物时已经广泛应用。然而，卟啉的吡咯环在生理条件下不足以与半胱氨酸反应。为了提高其亲电性，Pentelute（Nat. Chem. 2016, 8, 120-128）、Derda（Chem. Sci. 2016, 7, 3785-3790）、Diness（Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 8022-8026）和Harran（Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 674-678）等人开创性的工作证明了芳香族化合物的氟化增强了与半胱氨酸的反应性，即氟-半胱氨酸SNAr化学（图1）。这归因于氟原子最强的电负性，增加了全氟芳烃和八氟环戊烯中相邻碳的亲电性，从而与半胱氨酸残基高效反应。在卟啉生物偶联物的研究中，已有研究探索了用巯基糖或巯基聚乙二醇取代中meso-五氟苯基的单氟，以改善卟啉的生物相容性，但这种偶联几乎不能改变光物理性质。与之不同，在吡咯环上进行氟-硫醇交换的独特优势是操纵激发态和相关的光物理性质。因此，开发b-生物偶联新方法对于精细调节卟啉的生物相容性和光物理性质至关重要。 该工作中首先进行了理论计算，以预测b-氟吡咯-硫醇取代前后的光物理性质。随后，作者制备了10种水溶性b-八氟卟啉底物，并研究了其在生理条件下与半胱氨酸多肽/蛋白（绿色荧光蛋白、白蛋白）的成功偶联，产率高（80-99%）（图1）。实验表明，获得的β-肽基卟啉显示出卟啉Q带向NIR区域的红移，并增强有ROS的产生，增强光细胞毒性。然后，作者展示了该方法的几种潜在的应用场景，包括1）绿色荧光蛋白的胞内递送（图2），2）糖代谢标记，3）caspase-3检测。图2. b-氟吡咯-半胱氨酸SNAr化学辅助的硫辛酸冷冻开环聚合实现绿色荧光蛋白胞内递送。 该工作开发的生物偶联方法为赋予卟啉生物相容性、肿瘤靶向性和可调光物理性质提供了普遍可行的途径。卟啉类光敏剂已被广泛用作结合光动力治疗（PDT）和荧光成像治疗肿瘤的光诊疗试剂，但通常缺乏病灶特异性。因此，鉴于卟啉及其衍生物在生物医学中的重要性，作者进一步通过将卟啉P4与avb3整合素靶向肽f（cRGDFC）偶联来制备P4-f并将其应用于癌症选择性PDT。为了评估细胞特异性，作者进行了共聚焦荧光成像分析，以追踪整合素过表达的人肺癌细胞A549和低表达的人乳腺癌细胞MCF-7中P4、P4-a和P4-f的细胞内荧光（图3 a/b）。对于P4和P4-a，MCF7和A549细胞之间没有明显的荧光差异，而P4-f显示在A549细胞的荧光强度是MCF7细胞的3倍。这些结果表明，P4-f可以被具有过表达整合素的A549细胞选择性摄取。此外，当作者使iRGD（一种RGD抑制剂）阻断A549中的整合素时，与P4-f一起孵育的A549中的细胞内荧光下降到与MCF7细胞中相似的水平。这些实验结果表明，P4-f对A549细胞的选择性高于MCF7，而P4或P4-a是非特异性地被两种细胞系内化。 然后，作者通过尾静脉注射相应的化合物，评估了P4、P4-a和P4-f在A549肿瘤小鼠体内进行PDT的可行性（图3 c）。然后对肿瘤进行照射（注射后2小时，LED激光（400-700 nm），100 ，10分钟）。在14天的肿瘤生长监测期间（图3 d），作者在“P4-f+light”和“P4-a+light”组中观察到显著的肿瘤生长抑制。相比之下，其他组（“P4”或“P4+light”组）显示出很低的治疗效果。在治疗结束时，解剖肿瘤并拍照。如图3 e/f所示，“P4-f+light”治疗组的肿瘤体积和重量均小于其他组。与对照组（PBS）相比，所有治疗组的小鼠体重均未见异常变化，表明三种光敏剂均无明显的全身毒性。苏木精和伊红（H & E）染色表明在主要器官组织如心、肝、脾和肾中未发现损伤，进一步支持了这种生物安全性。因此，b-氟吡咯-半胱氨酸SNAr化学是高效开发新型b-肽基卟啉，作为肿瘤靶向光敏剂的新方法。图3. b-氟吡咯-半胱氨酸SNAr化学实现肿瘤靶向的活体光诊疗。 综上所述，这项工作开发了“一石二鸟”的b-氟吡咯-半胱氨酸SNAr化学，以实现卟啉的功能性生物偶联。该方法是高效的和模块化的，不仅实现了卟啉-多肽/蛋白质偶联，还诱导了优异的卟啉光物理性质，如吸收红移和激发态增加，以促进有前景的生物医学应用。目前的工作突出了卟啉生物偶联物作为潜在的光敏剂前景，以及通过操纵卟啉的激发态特征而获得的益处。通过安装b-硫原子实现的在卟啉结构和功能微调也将促进基于其他大环的新型生物偶联方法，并扩展小分子用于先进材料和生物医学研究的功能范围。 该工作中，北京大学张俊龙课题组博士生金国庆为该文的第一作者，张俊龙教授为通讯作者。该工作也得到了北京大学吕华课题组的大力支持。该工作得到了国家自然科学基金委、北京分子科学国家研究中心以及化学与精细化工广东省实验室等科研基金的资助。Link: https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/sc/d2sc06209g
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