分享一篇PNAS上的文章，本文的通讯作者来自The Scripps Research Institute分子医学系的Mia L. Huang教授和化学系的Christopher G. Parker教授。Huang实验室研究化学糖生物学中与干细胞分化研究，肌肉骨骼研究或癌症有关的问题。而Parker实验室旨在开发各种化学探针，并将其与蛋白质组学方法整合在一起，以扩大对可药用蛋白质组学的了解。
众所周知，聚糖结合蛋白（GBP）和聚糖之间的非共价相互作用参与了许多生物学过程，并且发挥了许多的生物学功能。而galectin-3是一种26 kDa的β-半乳糖苷GBP，在许多生理和病理事件中起关键作用，例如肝纤维化，凋亡等过程。然而galectin-3的完整相互作用的糖蛋白受体仍然未知。尽管糖科学领域取得了重大进展，但GBP-聚糖相互作用的研究以及糖介导的反受体的鉴定仍然是一个巨大的挑战。目前已经有使用聚糖微阵列、细胞裂解物的免疫沉淀和凝集素亲和技术已经鉴定了100到185个与galectin-3相关的蛋白，但是，这些操作会改变相互作者中蛋白本体以及三维结构和价态分布，这两个因素在GBP-聚糖相互作用研究中都至关重要。因此，开发一种能够实现活细胞中GBP-聚糖相互作用的研究，同时促进生理性糖蛋白受体鉴定的综合方法，在研究糖科学方面具有巨大潜力。在这里，本文作者使用galectin-3和APEX2酶的融合蛋白组成的邻近标记方法来绘制聚糖介导的galectin-3在活细胞中的相互作用。该方法可以灵敏地检测纳摩尔浓度下的galectin-3结合，同时作者还绘制了与galectin-3结合的蛋白质列表，并且验证了其中的直接聚糖介导的糖蛋白受体。
首先，作者将过氧化物酶APEX2酶遗传融合到全长galectin-3，并且比较了活细胞与细胞裂解物中的标记区别，发现都可以捕获了一部分潜在相互作用物，并用过量乳糖能够将竞争掉。为了鉴定假定的galectin-3相互作用蛋白，作者对肝星状细胞HSC进行了邻近标记，同时对所得的肽进行串联质量标记（TMT）标记。作者在两个重复实验中共鉴定出248种蛋白质。同时作者观察到使用galectin-3富集的蛋白质数量呈浓度依赖性增加，并且大多数富集蛋白质都是N-或O-糖基化的。
同时，作者用瞬转的方式在HSC中过表达galectin-3，评估该方法能够鉴定在细胞内表达的galectin-3的相互作用蛋白。将来自外源处理的富集的和聚糖介导的蛋白质相互作用进行比较，共同鉴定到的蛋白共有122种蛋白质。接下来，作者选择了其中一些蛋白进行验证。作者选用固定化的BSG，CD9，CD47，CD81，EPHB1，NPTN和VASN的人类重组蛋白，发现galectin-3以剂量依赖性方式结合，但是这并不能证明这些相互作用蛋白是否是由于聚糖介导的蛋白质相互作用。作者发现大多数蛋白质都与乳糖或TD139的存在竞争，但是这些任何竞争剂均未阻断CD81的结合，这说明CD81与galectin-3的结合可能是由非聚糖介导的蛋白相互作用介导的。
最后，作者接下来试图鉴定在LX-2 HSC中的具体的聚糖结构。通过用胰蛋白酶和PNGase F进行短暂处理，作者可以实现从完整的LX-2细胞中收获了N-聚糖。在MS分析之前，对游离的N-聚糖进行还原和过甲基化处理。使用在全MS扫描过程中获得的提取离子强度，可以确定最丰富的N-聚糖的相对定量。LX-2细胞表面上发现的最丰富的N-聚糖主要由复杂和低聚甘露糖组成，其中最丰富的是二唾液酸化的FA2G2S2，约占总数量的20％。同时作者还通过从galectin-3邻近标记中捕获的肽和糖肽混合物中鉴定出N-聚糖，从这些样品中获得的最丰富的N-聚糖总体上与所发现的在LX-2细胞表面上相似。同时，鉴于BSG作为galectin-3的聚糖依赖性结合受体的中心作用及其结合其他富集蛋白质的能力，作者试图鉴定BSG天然的N-糖基化模式。作者使用抗BSG抗体从LX-2细胞中免疫沉淀出BSG，并观察到与细胞表面N-糖基团相比存在明显差异。
总之，本文作者使用由galectin-3和APEX2酶的融合蛋白组成的邻近标记方法来绘制聚糖介导的galectin-3在活细胞中的相互作用。这种邻近标记策略可以高灵敏度地探测活细胞中聚糖依赖性相互作用蛋白。
本文作者：LSC
责任编辑：LYP
原文链接：
https://www.pnas.org/content/early/2020/10/15/2009206117
原文引用：https://doi.org/10.1073/pnas.2009206117
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