分享一篇发表在PNAS上的文章：Function-guided proximity mapping unveils electrophilic-metabolitesensing by proteins not present in their canonical locales，通讯作者是瑞士洛桑联邦理工学院的Yimon Aye教授，她们课题组主要研究亲电小分子参与的细胞通讯过程。这篇文章中作者开发了一种用于研究细胞内特定区域中蛋白对活性亲电代谢物响应能力的工具，用其发现了多种蛋白均在其非经典行使功能的区域处更易被修饰，并针对CDK9这一靶点进行了深入研究。
脂源性亲电小分子例如4-羟基壬烯醛(4-HNE)被认为是细胞应对氧化压力过程中的重要代谢产物，这些小分子能够以非酶催化的方式共价修饰蛋白上的亲核性残基例如Cys，这种修饰很可能参与了细胞氧化还原相关的信号传导过程。近年来的研究显示细胞内最先感受并对这些修饰发出响应的蛋白很可能只需要很低的修饰率，此前经典的研究手段例如竞争性的ABPP技术难以对修饰率很低的靶点进行发掘，并且无法区分细胞内不同区域间修饰情况的差异，因此本文作者希望开发一种能在特定细胞区域内发现代谢物sensor的方法。
作者所在课题组此前曾开发了名为T-REX的工具，用于研究单个蛋白相关的修饰及下游信号响应。本文中他们在T-REX基础上，利用融合有线粒体外膜/细胞核导向肽的Halo蛋白，以及可光控脱笼、并可靶向到Halo蛋白上的的caged-HNEyne，构建了新的名为Localis-rex的体系。原理是先将caged-HNEyne利用靶向基团连接到Halo蛋白上，从而实现将caged-HNEyne固定到特定的细胞区域，随后经光照后HNEyne被释放并对邻近的蛋白进行标记，被标记的蛋白最终可结合click反应及生物素富集等方式被质谱鉴定，同时他们结合了SILAC技术对线粒体外膜和细胞核中富集出的蛋白进行相对定量。
经过三次生物学重复，他们共找到了32个在其中两次重复中在某一细胞器中得到富集的蛋白，代表这些蛋白对于不同细胞器处释放的HNE具有不同的响应能力，他们发现其中约40%的蛋白均表在其非经典行使功能的区域处更易被修饰。进一步地，他们从中选取了部分靶点用T-REX技术加以验证，为了区分不同细胞器处的蛋白，他们在T-REX的基础上添加了细胞核导向(NLS)/细胞核排斥(NES)序列，从而控制外源表达的蛋白的不同定位。经过验证发现，这些蛋白在位于细胞核或胞质中时的确对HNE有不同的响应能力，并且这种现象在外加过量的HNE处理下会得到类似的结果，说明并非由T-REX的低HNE剂量导致。
最后作者从中挑选了CDK9这一靶点进行深入研究，CDK9是一个经典的在核内行使其影响转录功能的蛋白，但前面的数据显示CDK9在细胞质内更易对HNE进行响应。为了对这一现象进行解释，作者结合T-REX技术及其它手段最终发现，HNE在细胞质中对CDK9的修饰会介导CDK9向核的迁移，进而影响其在核内与CyclinT1的结合，导致RNA聚合酶II活性的下降，最终影响转录过程。
总之，这篇文章发展了Localis-rex这一具有空间分辨率的研究活性代谢物对蛋白修饰的工具，并发现了HNE信号在胞质内由CDK9传递到核内这一独特的机制。
本文作者：LDY
责任编辑：Guo ZH
原文链接：https://www.pnas.org/content/119/5/e2120687119#ref-22
文章引用：DOI：10.1073/pnas.2120687119
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