分享一篇发表在Nature Biotechnology上的文章：Genetically encoded photo-switchable molecular sensors for optoacoustic and super-resolution imaging。本文的通讯作者是慕尼黑亥姆霍兹中心的Andre C. Stiel，Stiel研究员对光控蛋白有浓厚的兴趣，近年来他的工作集中在利用光控蛋白开发光声成像工具和对动物组织深处进行光声成像上。本文中，作者基于GCaMP5G发展了一种光控钙探针，这种探针可以用488/405 nm的光进行开关。作者在结构层面阐释了这种探针的工作机理，将其用于超分辨和光声钙成像，并尝试利用这一光控蛋白开发麦芽糖和多巴胺探针。

可逆开关荧光蛋白（RSFPs）可以通过不同波长光照刺激在亮态（cis）和暗态（trans）之间转换。这一特性使它们在一些超分辨成像技术如RESLOFT中成为不可或缺的存在。此外，由于RSFPs具有光激活特性，也常被用于提高成像信背比，在对组织进行光声成像时，组织会吸收激发信号产生较强背景，这时RSFPs的优势就更加明显。本文中，作者提出了基于光激活的基因编码探针（rsGEI）这一概念，这类探针在结合目标分子后才能在光激活下报告荧光信号。

首先，作者基于GCaMP5G和rsEGFP2构筑了rsGCaMP1.1，实现了钙离子结合下488 nm通道的光控开关。然而rsGCaMP1.1的荧光量子产率过低，于是作者在生色团附近选取位点进行突变，对探针的Ca离子亲和力进行优化以用于内质网（ER）的钙离子分布检测，最终得到了亮度上有所提升的rsGCaMP1.4-ER。

在接下来的结构分析中，作者对rsGCaMP和各种突变体进行结晶和X射线衍射分析，仅有rsGCaMP1.1以单体形式结晶，其余突变体均为二聚体，且这些结晶可以在488 nm和405 nm下实现开关。X射线衍射分析清晰展现了探针在开关态下的cis/trans异构化，两个状态下除R57和E126外其余位点均没有发现氢键相互作用。作者推测rsGCaMP的快速光开关及较慢的光疲劳速率与此相关。另外，作者发现rsGCaMP1.1的异构化并不是以单键翻转形式实现的（多数RSFP是单键翻转机理），而是通过hula-twist（HT）实现的。作者继续突变rsGCaMP，获得亮度显著增加的rsGCaMP1.2和rsGCaMP1.3，相较于初代rsGCaMP，I71H增强了蛋白与水的相互作用，V107T帮助稳定了开态生色团。

接下来，作者先在脂质包被的beads上用MoNaLISA对rsGCaMP1.4-ER成像，发现在高Ca条件下，成像分辨率存在显著提升，说明rsGCaMP存在应将用于高分辨成像的潜力。作者于是rsGCaMP1.4-ER表达在ER中，Kd = 72 μM的rsGCaMP1.4-ER在钙离子浓度~500 μM的ER中较增强共聚焦显微镜显著提高了成像分辨率，表明rsGCaMP用于高分辨成像是可行的，同时，时间分辨成像仅包含的运动伪影较小。

随后作者将表达rsGCaMP1.1的HeLa细胞移植到小鼠背部，施加488 nm/420 nm脉冲，in vivo光声成像可以清楚地区分出Ca/ionomycin处理的细胞（右侧）和未处理细胞（左侧），证实rsGCaMP有应用于光声成像的潜力。

rsGEI的概念也可用于其它探针：作者将rsEGFP整合进入麦芽糖结合蛋白PBP和基于GPCR的多巴胺探针dLight的骨架，发展了初代的麦芽糖和多巴胺探针。两种探针均表现出了结合配体后的光控开关效应，然而其响应强度和亮度仍有待优化。

总而言之，作者基于基因编码钙探针GCaMP5G和rsEGFP发展了一系列光控开关的rsGCaMP探针，证实其可以在超分辨和in vivo光声成像中发挥报道钙离子浓度变化的作用。同时，作者也将rsGEI的策略尝试用于其他探针骨架，证明rsGEI策略可以广泛用于开发多种基因编码光控探针。