分享一篇发表在Angew上的文章One-step enzymatic labeling reveals a critical role of O-GlcNAcylation in cell-cycle progression and DNA damage response，通讯作者是来自浙江大学的Wen Yi教授，他们主要研究化学糖生物学及相关蛋白翻译后修饰。
O-GlcNAc是一种普遍而动态的蛋白翻译后修饰之一，在许多细胞过程中都起着非常重要的作用，其细胞循环是通过O-GlcNAc转移酶和水解酶的作用来实现的。最近，已经发展了一些策略来捕获、鉴定细胞内的O-GlcNAc修饰蛋白。例如，通过合成含有生物正交功能基团的GlcNAc类似物，从而进行代谢标记实现O-GlcNAc修饰蛋白的成像和检测；另一种替代策略通过利用重组半乳糖苷转移酶(GalT)，将含有叠氮基团的N-乙酰半乳糖胺(GalNAz)转移到O-GlcNAc修饰上，随后通过click反应进行捕获和鉴定(图1A)。然而，第二步反应可能由于连接缓慢而导致反应不完全，或在细胞复杂环境中发生各种副反应。而越来越多的证据表明，可以通过对糖基转移酶进行改造来扩大其底物范围，作者希望开发仅通过一步化学酶法的标记策略来对O-GlcNAc修饰进行鉴定，并提高灵敏度。
首先，为了转移具有更大官能团的糖供体，作者试图确定GalT中的哪些残基是突变的目标。研究表明，Y289L突变可以适应C-2位附加修饰的糖供体底物，作者进一步对GalT的结构进行分析，推测K279A和F280A突变将为C-2位创造更大的容纳空间(图1B)。单突变体和双组合突变体与图1C一系列GalNAc衍生物的体外实验表明，相比于未经修饰的UDP-GalNAc，附加基团的引入降低了各种酶的活性。但K279A突变体对类似物2有着较好的活性和特异性，因此被选择用于进一步的细胞研究。
图1
作者随后使用K297A突变体和类似物2对HEK293T细胞进行标记和蛋白质组学分析，并与传统的两步标记方法进行了比较。发现一步法成功鉴定到740个蛋白，错误率小于1%；而两步法只能鉴定到570个蛋白，一步法的标记效率更高。在这些一步法鉴定到的蛋白中，FEN1是此前从未被报导过的O-GlcNAc修饰蛋白，它是一种多功能酶，对DNA复制过程中冈崎片段的合成与碱基切除修复密切相关。于是作者研究了FEN1在细胞周期进程中的糖基化现象，发现其糖基化随细胞周期波动，G1期的糖基化水平远高于S期(图2)；当使用DNA损伤剂处理时，FEN1的糖基化水平也会升高。此外，作者还通过LC-MS/MS证实S352是细胞中FEN1糖基化的主要位点。
由于在细胞周期的S期，FEN1可通过与增殖细胞核抗原PCNA相互作用从而定位到DNA复制位点，作者分析了FEN1-PCNA的结构，推测S352的糖基化可能破坏FEN1与PCNA的相互作用(图3)，并得到了实验证实。最后，作者通过在细胞内表达S352C的高糖基化突变体，证明O-GlcNAc修饰抑制了FEN1与PCNA的相互作用，导致细胞周期改变和DNA复制缺陷，并增加细胞对DNA损伤剂的敏感性。
图2 图3
总之，作者通过酶改造建立了一步化学酶法标记并捕获O-GlcNAc修饰的策略，并成功鉴定到新的O-GlcNAc修饰蛋白FEN1，揭示了其在DNA损伤修复中的动态调节作用。
本文作者：WFZ
责任编辑：WQW
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202110053
文章引用：DOI:10.1002/anie.202110053
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