分享一篇2018年发表在Nat. Struct. Mol. Biol.的文章，文章的题目是“UbiSite approach for comprehensive mapping of lysine and N-terminal ubiquitination sites”。本文通讯作者是来自南丹麦大学生物化学与分子生物系的Prof. Blagoy Blagoev，其课题组致力于结合质谱定量蛋白质组学和分子/细胞生物学研究信号网络的特征，重点关注其翻译后修饰（如磷酸化和泛素化）的调节。 
泛素化是一种常见的蛋白翻译后修饰（PTM），揭示泛素化蛋白质的特性及其修饰位点可以极大地有助于理解许多生物过程及其在癌症，炎症和神经变性等疾病中的功能障碍。目前质谱（MS）是鉴定和表征泛素化最有效的方法，但MS受限于泛素化修饰量，且提供有限的泛素化确切位点信息。作为一种补充方法，抗体K-ε -GG可以识别胰蛋白酶消化后泛素化赖氨酸上存在双甘肽残基（diGly）。然而，该单克隆抗体也存在对靠近修饰赖氨酸的某些氨基酸环境有偏倚性，不允许富集源于N-端泛素化蛋白的肽，以及无法区分泛素与泛素样蛋白（NEDD8和ISG15）的附着等缺点。因此，本文描述了一种新的单克隆抗体UbiSite，通过特异性识别LysC内肽酶水解后留在蛋白靶标上的独特泛素残基，结合质谱技术用于分析特异性富集和鉴定泛素化位点。1. 利用UbiSite高效富集泛素化肽和深入分析泛素化位点为了能够在位点特异性水平上描述蛋白质泛素化，作者构建了一种可以识别泛素C-端的13个氨基酸残基（ESTLHLVLRLRGG）的单克隆抗体UbiSite，并建立了一个高效分离和鉴定泛素化肽的工作台。如图1 a 所示，在LysC酶消化培养细胞或组织中的蛋白质提取物后，使用UbiSite抗体富集泛素化肽，然后直接用LC-MS/MS进行分离和分析，或者用胰蛋白酶进一步消化，生成更适合标准LC-MS/MS测量的双甘肽残基短肽。应用此工作台，将Hep2和Jurkat细胞系经载体或蛋白酶体抑制剂（硼替佐米或b-AP15）处理后用UbiSite共确定了63455个独特的泛素化位点，其中Hep2和Jurkat细胞分别发现7574、38867个位点，并且64%未在PhosphositePlus数据库（PTM位点库）中报道过。此外，UbiSite富集鉴定的泛素化位点无赖氨酸周围基序序列偏好性。2. Hep2和Jurkat细胞的全局蛋白质组和UbiSite富集泛素组的无标记定量为了估计UbiSite测量的深度，作者在无抑制剂处理的条件下对正常生长的Hep2和Jurkat细胞的总蛋白质组进行了无标记分析。在每个细胞系中鉴定出超过11000种独特的蛋白质，并将10000个蛋白质分类为不同的丰度类别。通过比较硼替佐米和b-AP15处理后细胞泛素组的变化发现，数千个泛素化位点对这两种针对蛋白酶体的抑制剂的治疗有显著差异，富集结果显示，与b-AP15相比，硼替佐米处理的细胞中与内质网相关的蛋白质泛素化特异性增加。然而，无论细胞系或治疗方法如何，蛋白质丰度的变化与蛋白酶体抑制时泛素化位点的改变完全缺乏相关性。图3 蛋白丰度变化与泛素化位点偏离响应蛋白酶体抑制的相关性分析为了研究这种普遍的泛素化是否与特定的细胞功能或过程有关，作者根据修饰位点的数量以及序列中赖氨酸被泛素化的百分比对泛素化蛋白进行了排名，处于前25%的蛋白质被认为是广泛泛素化蛋白质（EUPs），在Hep2和Jurkat细胞中分别发现有1376和1333个EUPs。尽管在EUP类别中发现了许多低丰度蛋白，但明显趋向于表达水平较高的蛋白，而且最丰富的类别都与一种非膜结合细胞器的不同成分有关，即中心体。EUP列表中总共有184种具有中心体相关注释的蛋白质，这表明泛素化广泛调节这种多功能细胞器。UbiSite对泛素具有特异性，除了赖氨酸残基上的泛素化，蛋白质N-端泛素化也很容易被检测到。作者从已鉴定的104个N-端修饰蛋白选取了10个具有不同分子量、亚细胞定位和功能的候选分子来验证UbiSite识别N-端泛素化的能力，通过免疫沉淀结果确认了十种赖氨酸缺陷突变体泛素化的能力。同时，所有突变体都有高分子量的泛素偶联物，这表明N-末端连接的泛素可以作为后续泛素链形成的平台。研究发现，104个N-端泛素化修饰分布在所有表达水平的蛋白质中，而且N-端泛素化修饰蛋白的肽强度分布与整个泛素组的肽强度分布完全一致，表明了赖氨酸泛素化和N-端泛素化的总体化学计量是相似的。然而，对比赖氨酸泛素化，N-端泛素化修饰倾向存在于N-端第二位氨基酸为脯氨酸或缬氨酸的蛋白质上，其中脯氨酸发生率最高；N-端乙酰化修饰，蛋白质中另外一种最常见的PTMs，则与N-泛素化修饰存在显著的负相关关系。本文通过描述两种人类细胞系Hep2和Jurkat的泛素组来证明UbiSite方法的有效性，然后将这两种细胞系量化到10000个蛋白质的深度。在两种人类细胞系的9200种蛋白质中鉴定了63000多个独特的泛素化位点，鉴定结果发现许多蛋白质在其赖氨酸残基上广泛泛素化，没有观察到泛素化赖氨酸周围的序列有任何偏好，而且也不偏向于任何特定功能或亚细胞定位的蛋白质。这些数据强调了泛素化的广泛性，以及UbiSite对这种普遍的PTM的综合分析的实用性。蛋白质组和泛素组的比较显示泛素化在所有细胞位置的蛋白质上普遍分布，并且基本上参与所有细胞过程。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41594-018-0084-y原文引用：10.1038/s41594-018-0084-y
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