为大家介绍一篇2019年发表在NCB上的文章，题目为“Site-specific acylation of a bacterial virulence regulator attenuates infection”。本文的通讯作者是Script研究所的Howard C. Hang，专注于研究化学信号（代谢产物）调节宿主微生物在感染和免疫中相互作用的分子机制。
肠道菌群产生毫摩尔浓度的短链脂肪酸（SCFA），包括乙酸，丙酸和丁酸等，可以调节宿主的新陈代谢、免疫力和对感染的易感性。特别是丁酸盐可以作为碳源和抗炎代谢物，但它抑制病原体毒力的机制研究还不清楚。
作者合成了丁酸炔烃类似物探针alk-3，利用该探针通过LFQ富集了56种蛋白质，其中，HilA是SPI-1（沙门氏菌致病岛1）基因的关键转录调节因子，是沙门氏菌中最突出的酰化蛋白之一。HilA蛋白含有N末端DNA结合结构域以及朝向C末端的TPR结构域。作者在细菌中表达了HA-HilA蛋白，然后用alk-3处理，发现探针标记是浓度依赖的。作者发现在菌中高表达了酰基转移酶YfiQ（Pat）或脱酰基酶CobB对alk-3的标记没有太大的影响，表明HilA酰化是通过赖氨酸残基的化学酰化发生的，进一步的，作者敲除了其他蛋白酰基转移酶基因，alk-3的标记也没有发生变化，进一步表明毫摩尔水平的外源性丁酸盐通过化学手段酰化HilA蛋白。作者表达并纯化了HilA-HA-His6与丁酸盐孵育以鉴定酰化位点，鉴定了五个赖氨酸（K90、K231、K324、K456和K533），通过Rosetta预测五个酰化赖氨酸残基都位于潜在的化学酰化表面暴露位点，并且处于预测的DNA结合（K90）或蛋白质-蛋白质（K231，K324，K456）相互作用域中，其中K90是最突出的酰化位点。2.将酰化赖氨酸类似物嵌入到HilA蛋白的特定位点中作者通过遗传密码扩展技术（非天然氨基酸嵌入）将丁酰化赖氨酸嵌入到HilA蛋白的特定位点，评估了其他丁酰化赖氨酸类似物跟其他氨酰tRNA合成酶PylRS突变体的嵌入效率，最后确定bmK作为丁酰化赖氨酸的类似物用于鼠伤寒沙门氏菌中HilA蛋白K90酰化的嵌入。接着作者使用CRISPR–Cas9基因编辑技术在沙门氏菌中染色体引入K90A、K90Q和K90TAG突变体，HilA-HA、K90A和K90Q（乙酰化模拟物），对SPI-1基因的表达水平没有影响。然而，HilA-K90-bmK显示SPI-1基因表达显着降低，几乎达到敲除HilA水平。SPI-1基因表达差异影响沙氏门菌感染HeLa细胞，但是对RAW2.264巨噬细胞影响不明显。这些结果表明，经典的定点诱变为典型氨基酸可能无法揭示位点特异性代谢物修饰如何调节细胞中的蛋白质功能。因此作者在沙门氏菌中HilA蛋白的K231，K324，K456，K533，K57和K527处生成了密码子突变体，包括酰化和未酰化的，可以对比蛋白质表达和活性。作者发现这些突变株的生长速度跟野生型的一致，且bmK修饰能够高效地嵌入到HilA-TAG-HA中并通过生物正交接上荧光团，且bmK的存在决定了HilA-HA密码子突变株的表达。K57/K90/K527-bmK不影响HilA表达，而K231/K324/K456/K533-bmK产生的HilA含量略低。HilA-bmK蛋白水平与SPI-1分泌蛋白水平无关，表明HilA蛋白的位点特异性丁酸酰化对功能的影响。图4. 将酰化赖氨酸类似物嵌入到HilA蛋白的特定位点中然后作者评估了沙门氏菌中HilA特定位点酰化突变体的转录活性。通过qRT-PCR表明，相对于WT HilA-HA，在K57，K90，K324和K456处位点特异性嵌入bmK降低了SPI-1基因不同操纵子prgH，invF，sipA，orgB和spaO的表达。K57和K90存在HilA的DNA结合界面中，在bmK嵌入后HilA靶基因的表达显着降低。K324和K456存在HilA的TPR结构域，嵌入bmK后也损害了SPI-1基因的表达。而K231和K527嵌入bmK后SPI-1表达略有增强。接着作者分析了这些沙门氏菌侵袭HeLa上皮细胞系的情况。与HilA-HA中的其他赖氨酸残基相比，在K57、K90、K324和K456处嵌入bmK会衰减沙门氏菌感染HeLa细胞的能力，而K231，K527和K533 bmK突变体与野生型相比显示出增强或相似的感染水平，但是在RAW264.7巨噬细胞中无显著差异。这些结果表明，HilA的特定位点赖氨酸丁酰化调节沙门氏菌对上皮细胞的侵袭。由于K90是HilA蛋白最重要的酰化位点，且K90-bmK突变体对SPI-1基因的表达跟沙门氏菌的感染能力密切相关，故我们针对该位点进行其额外功能研究。将HilA蛋白与丁酸盐孵育发现K90的丁酰化水平增加，为了研究K90丁酰化的影响，作者通过交联和HA免疫沉淀测序/qPCR（x-IP-seq/qPCR）发现K90/K57-bmK降低其在HilA靶基因（prgH和invF）启动子的占有率，影响了其与DNA（靶基因启动子）的结合。而K324/K456-bmK不影响其在HilA靶基因启动子占有率，其抑制作用可能不是通过抑制DNA结合起作用，而是通过TPR结构域相关机制起作用。图6. HilA K90酰化影响其在靶基因启动子的占有率4.HilA K90酰化影响小鼠伤寒沙门氏菌在小鼠肠道传播感染作者构建了链霉素治疗的小鼠伤寒沙门氏菌感染模型，该模型会消耗产生丁酸盐的微生物群体，为bmK的嵌入提供了SCFA缺陷环境。与HilA敲除株相比，鼠伤寒菌株在链霉素治疗小鼠口服感染时的总体发病机制水平相似，可能是由于体内多天后bmK的耗竭和全长HilA蛋白表达失活。作者用bmK标记的WT和HilA突变体口服感染链霉素处理的小鼠，收集其淋巴结和肝脏，并通过选择性琼脂平板测量集落形成单位（CFU）。与WT相比，K90-bmK在肠道传播方面有缺陷，类似于HilA敲除，而K231-bmK与WT相似。对肠道切片的组织学分析显示，WT在小鼠盲肠中引起明显的炎症，而K90-bmK突变体在盲肠中具有轻度或没有炎症。图7. HilA K90酰化影响小鼠伤寒沙门氏菌在小鼠肠道传播感染作者发现HilA-K90/K324/K456R染色体突变株对丁酸盐抑制的SPI-1基因表达以及HeLa细胞的侵袭具有抗性。因此与野生型相比，在丁酸盐充足的条件下，感染HilA-K90/324/456R突变株的小鼠生存时间更短。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41589-019-0392-5原文引用：https://doi.org/10.1038/s41589-19-0392-5.
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