“A tandem activity-based sensing and labeling strategy enables imaging of transcellular hydrogen peroxide signaling”^[1]该通讯作者是于2005年加入University of California, Berkeley的Christopher J. Chang教授。他的研究方向主要是：1)Transition Metal Signaling: Tetllallostere in the Brain and Beyond.2) Activity-Based Sensing: Redox and One-Carbo Signaling.3)Arificial Photosynthesis: Catalyzing Sustainable Electrosynthesis.

    该文于2021年1月7日发表于Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)。作者在此前也发表过许多与PG1-FM类似带有硼酸酯结构的荧光团，同样也是用来检测过氧化氢分子^[2]。

1. 简介

   过氧化氢(H₂O₂)是一种Reactive oxygen species(ROS)，它既可以诱发氧化应激，也可以作为信号分子参与到细胞生长、分化、迁移和死亡等途径的调控。它除了在免疫反应中起着杀死病原体的作用外，由非吞噬细胞的NADPH氧化酶(Nox)通过超氧化物产生的H₂O₂还可以触发信号事件，包括干细胞生长和增殖、昼夜节律、伤口愈合等。

       由于其在细胞内存在的半衰期极短，因此它在细胞内的精确检测存在一定的挑战。尽管H₂O₂体积小且相对非极性，但它不能通过细胞膜自由扩散，而且进入细胞的过程受到严格的调控。有些研究已经找到一种水通道的特定亚型作为H₂O₂的内源性介质来介导其在胞内运输^[3]。

       对H₂O₂在细胞外通讯中的作用还没有充分了解的部分原因是由于化学工具的局限性。传统的H₂O₂小分子荧光探针的缺点在于ROS检测后会发生扩散，导致信噪比降低。该文的PG1-FM探针弥补了这一缺点，其可与蛋白质共价结合从而固定在胞内特定位置。

2. 合成路线

       探针PF2^[2]对H₂O₂敏感，但缺乏近端氟甲基基团不能进行生物分子标记，在后面的生物实验中被用作对照化合物。

3. 机制探讨

       探针PG1-FM是一种基于串联活动的H₂O₂成像传感和标记策略的荧光探针，能够在定义的时间尺度上捕获和记录空间信息。该探针包含一个硼酸酯基团，其在H₂O₂的催化作用下发生硼酸酯-苯酚的转化，转化后羟基并不稳定，可以发生烯醇互变。随后，其邻位氟亚甲基发生消除反应，通过迈克尔加成反应与蛋白共价结合，作为一个荧光分子停留在细胞的特定位置上，并提供永久性染色，保存局部H₂O₂通量的空间信息。该文用HPLC对此机理进行了验证。

4. 生物实验

       在对探针PG1-FM在PBS环境中的荧光强度以及在生物环境中的选择性进行表征后，该文分别利用PG1-FM来成像不同刺激条件下四种类型细胞模型产生的内源性H₂O₂的通量。实验人员利用百草枯(paraquat)诱导H₂O₂生成后，暴露于百草枯的HeLa cells显示出H₂O₂依赖性荧光增加。由于A431 cells具有高表达的表皮生长因子受体 (EGFR)，实验人员利用表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)通过刺激Nox产生H₂O₂，进而诱导PG1-FM的荧光增强。而第三种细胞模型则是选择了RAW 264.7 macrophages cells 通过佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)刺激超氧化物生成H₂O₂来进行诱导。

     此外还选择小胶质细胞-神经元共培养模型（Microglia–Neuron Coculture Model）来提供了一种通过选择性激活小胶质细胞来观察ROS从一种细胞类型(小胶质细胞)转移到另一种细胞类型(神经元)的方法。小胶质细胞是中枢神经系统中特化的寄生巨噬细胞，在脂多糖(LPS)和干扰素(IFN -γ)的刺激下，可通过超氧化物激活产生H₂O₂，而神经元不会以这种方式对LPS做出反应。

       通过敲除phox证实了神经元中H₂O₂水平的升高依赖于p47^phox介导的在小胶质细胞中产生的ROS，而不是通过信号诱导神经元ROS的产生。p47^phox(phox:吞噬细胞氧化酶)是吞噬细胞NADPH氧化酶的一个亚单位，它被认为是小胶质细胞产生超氧化物和H₂O₂的必需因子。P47^phox-/-的小胶质细胞即使在LPS/IFN-γ刺激下也是如此无法产生Nox和H₂O₂。

Iba-1(红色)作为小胶质标记物，MAP2（蓝色）作为神经元标记物

        以上实验也都使用流式细胞术验证了观察到的荧光增强。

5. 总结

       PG1-FM是一种基于活性传感和标记的双功能策略的荧光探针，可用于高选择性和灵敏度的H₂O₂荧光检测，并且能够在时间维度上捕捉和记录空间信息。探针上的硼酸酯基团在识别H₂O₂后，通过与周围蛋白发生共价标记，从而触发探针的荧光，以实现H₂O₂空间信息的永久保存。该文分别对三种细胞进行共聚焦和流式细胞术检测。在一种共培养模型中进行共聚焦拍摄，并通过敲除phox证实了神经元中H₂O₂水平的升高依赖于p47^phox介导的在小胶质细胞中产生的ROS，而不是通过信号诱导神经元ROS的产生。

       PG1-FM可以对细胞内及细胞间的H₂O₂信号进行检测。除了识别ROS介导的细胞间通讯外，还可以为结合基于活性检测与标记策略来设计高空间保真度的化学探针提供参考，为破译生物学信息提供了一种新的思路，可进一步推广到对细胞中各个信号分子的检测。

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[1] Hidefumi Iwashita, Erika Castillo, Marco S. Messina, Raymond A. Swanson, Christopher J. Chang, A tandem activity-based sensing and labeling strategy enables imaging of transcellular hydrogen peroxide signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 118 (2021).

[2] Dickinson, B. C., Huynh, C., Chang, C. J., A Palette of fluorescent probes with varying emission colors for imaging hydrogen peroxide signaling in living cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 5906-5915 (2010).

[3] E. W. Miller, B. C. Dickinson, C. J. Chang, Aquaporin-3 mediates hydrogen peroxide uptake to regulate downstream intracellular signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15681–15686 (2010).