分享一篇2021年9月份发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章，该文的通讯作者是中科院大连化物所研究员刘宇。刘宇研究员的主要研究方向是新型荧光分子全谱观测蛋白质相分离过程中的构型变化，新型早期临床诊断方法和高通量药物筛选平台，以及发展化学探针解析活细胞内药物靶点结合效力。该文的第一作者是万旺和曾亮钢。
由于基因突变、翻译后修饰、外源毒素和细胞胁迫等原因，蛋白质常发生错误折叠和聚集。细胞内蛋白质的错误折叠与聚集会引发多种蛋白质构象疾病，如阿尔茨海默症和心肌淀粉样变等。蛋白质分子在错误折叠和聚集状态下的生物化学和生物物理特性已得到广泛研究。然而，针对其物理和化学性质（如极性、粘度、氧化还原性质、化学反应性等）的定量信息相对匮乏。此外，近期多项研究显示，聚集蛋白质的理化性质与其致病机制有着密切关系。
鉴于此，作者发展了一例对极性和粘度具有双重敏感性的荧光探针P1（图1b），该类探针可选择性结合聚集蛋白质，并根据其内部极性的不同发出不同波长的荧光。利用所构建的波长与极性的线性关系，可定量测量不同聚集蛋白质的极性。通过活细胞荧光成像，揭示了细胞内致病聚集蛋白质的极性异质性。该工作为后期进一步通过蛋白质组学分析聚集蛋白质提供了新的研究方向。
图 1 （b）P1具有检测极性和粘度的双重敏感性。（c）P1的极性定量灵敏度。（d）P1的粘度定量灵敏度。为了检测蛋白质聚集间期的极性变化，探针需要具有溶剂变色荧光特性。作者首先证明了P1是溶致变色的，从图1c中可以看出，随着溶剂极性增大，P1的最大荧光发射波长红移，这可以用光照后的分子内电荷转移（ICT）机制进行解释，同时，P1的最大荧光发射波长与溶剂介电常数之间存在严格的线性关系，因此，P1可以定量分析微环境极性。为了减小溶剂极性对荧光发射强度的影响，作者选用极性相似的甘油-乙二醇混合物制备不同粘度的溶液测试P1粘度灵敏度，结果表明，P1的荧光强度表现出粘度相关的增加，粘度灵敏度为0.29（图1d）。粘度敏感性可用控制扭曲分子内电荷转移(TICT)机制进行解释。此外，作者发现P1只在结晶固体时发光，而在水沉淀的非晶态固体时不发光，使P1成为一个结晶诱导发光（CIE）荧光团。这一结果表明P1可能需要在晶体中排列良好的π-π堆积来完全抑制所有可能的振动和旋转运动，从而有效地发出荧光。
图 2 （a）P1在热诱导的DHFR蛋白质聚集时产生荧光。（b）OD330浊度测量DHFR不溶性聚集，P1荧光发生的温度比OD330浊度变化时的温度低。（c）P1在DHFR可溶性低聚物中发出荧光。F：折叠；M：错误折叠；I：不溶性。（d）对完全聚集的DHFR进行分馏，P1在不溶组分中保留了荧光。T：总；S：可溶性部分；I：不溶性部分。（e）、（f）P1对聚集蛋白质的选择性结合亲和力高于折叠蛋白。为了检测蛋白质聚集间期的极性变化，探针除了需要具有溶剂变色荧光特性外，还需要具有对聚集蛋白质固有的结合亲和力和选择性。使用二氢叶酸还原酶（DHFR）作为模型蛋白质，作者发现P1在热诱导的DHFR聚集时表现出淡黄色荧光（λem=555 nm，荧光强度增强15倍），表明了P1对聚集蛋白质DHFR的固有结合亲和力（图2a）。接下来，作者评估了P1与聚集蛋白质的选择性。首先，对完全聚集后的蛋白质（T）进行荧光读数，然后对另一个平行样品进行离心分离，得到可溶（S）和不溶（I）部分，并进行荧光读数，结果表明P1在不溶性聚集物中表现出荧光（图2d）。此外，将可溶折叠DHFR、不可溶聚集DHFR、P1进行孵育，在可溶折叠DHFR和不可溶聚集DHFR之间提取P1，大部分P1在不溶部分得到，表明P1对聚集蛋白质的选择性结合亲和力高于折叠蛋白（图2e，2f）。由于P1具有独特的极性灵敏度和聚集蛋白质选择性，作者开始测量不同聚集蛋白质内部的极性，包括重组单体转肽酶、野生型和突变型二氢叶酸还原酶（DHFR）、转甲状腺素蛋白（TTR）、人免疫球蛋白（Ig），根据先前的标准曲线，利用P1的荧光发射波长量化了不同聚集蛋白质内部的介电常数（图3a）。作者进一步剖析了不同蛋白质在整个错误折叠和聚集过程中极性和粘度变化的动力学特征。以转肽酶为例，在时间和温度相关的蛋白质聚集实验中（图3c，3d），作者发现P1最大发射波长的降低发生在OD330浊度信号增加之前，即极性的变化主要发生在蛋白质的错误折叠过程中，而不是在形成不溶性聚集蛋白质过程中。另一方面，以转肽酶为例（图3f），在温度相关的蛋白质聚集实验中，反映聚集蛋白质黏度的荧光强度变化与OD330信号更为相关，这表明，错误折叠的可溶性低聚物生成不溶性聚集物的过程，其粘度增加。极性主要在蛋白质错误折叠过程中降低，粘度主要在错误折叠的可溶性低聚物生成不溶性聚集物过程中增加（图3e）。
图 3 （a）P1的荧光发射波长量化了不同聚集蛋白质内部的介电常数。（b）聚集TTR和聚集转肽酶的透射电镜图像。（c）、（d）在时间和温度相关的转肽酶错误折叠和聚集实验中，P1的荧光发射波长测量到的极性变化发生在OD330测量到的不溶性聚集物形成之前。（e）极性主要在蛋白质错误折叠过程中降低，粘度主要在错误折叠的可溶性低聚物生成不溶性聚集物过程中增加。（f）反映聚集蛋白质粘度的荧光强度变化与OD330信号更为相关。
最后，作者使用以前报道过的AggTag技术，量化了活细胞中聚集蛋白质的极性，揭示了细胞内聚集蛋白质的极性异质性。首先，作者将P1修饰HaloTag的配基得到P1-Halo（图4a），并测试了P1-Halo的荧光属性，修饰前后探针的溶剂变色性能无明显变化。通过共聚焦成像，P1-Halo探针可以选择性检测Halo标记的亨廷顿病模型蛋白Htt–110Q的聚集和肌萎缩性侧索硬化症（ALS）疾病模型蛋白突变体SOD1（G85R）的聚集。图4b，Htt–polyQ蛋白质的聚集导致胞质中出现大斑点状荧光，而突变体SOD1蛋白质的聚集导致胞质中出现弥散状和小斑点状荧光。点状荧光在以前的研究中被认为是不溶性聚集物，而弥散状荧光被认为是可溶性低聚物。然后，作者通过共聚焦成像对活细胞中聚集蛋白质的极性进行了定量。结果表明，不同的蛋白质聚集导致不同的极性，同时，在细胞环境中折叠蛋白质比对应的聚集蛋白质表现出更高的极性（图4c）。其次，当放大到一个点时，聚集的Htt–110Q蛋白质的外壳比核心的极性略大，揭示了蛋白质内部极性结构的异质性（图4d）。在图4e中，可溶性低聚物(弥散状荧光)和不溶性聚集体(点状荧光)极性有明显差别。
图 4 （a）AggTag方法选择性检测目标聚集蛋白质的方案。（b）在共聚焦成像下，P1-Halo探针显示了目标蛋白质的聚集。（c）、（d）、（e）聚集蛋白质的极性异质性。
综上所述，作者提出了一种溶剂变色结晶诱导发光的荧光团，对错误折叠和聚集的蛋白质具有固有的结合亲和力，以此量化聚集蛋白质的极性。在蛋白质聚集的过程中，作者发现了丰富的极性复杂性。该探针还揭示了细胞中聚集蛋白质的极性异质性。通过对新型染料环境敏感性、靶向策略和荧光化学进一步分析聚集蛋白质的其他物理和化学性质，可能为蛋白质聚集的疾病机制和治疗发展提供另一个视角。该研究发展的方法仅限于报道聚集蛋白质内部的平均环境信息。
作者：谷晓玉
核稿者：张馨、刘丽
上传者：刘继红
原文链接:
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202107943
原文引用：
https://doi.org/10.1002/anie.202107943
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