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分享一篇2020年发表在JACS上的文章，文章题目是“AggFluor: FluorogenicToolbox Enables Direct Visualization of the Multi-Step Protein AggregationProcess in Live Cells”。在这项工作中，美国宾州州立大学张鑫教授团队设计了不同粘度响应的荧光探针，实现了活细胞中蛋白质聚集过程的精准观测。
蛋白质聚集是一个多步骤过程，并报道与越来越多的人类疾病有关，如神经退行性疾病，代谢性疾病和某些癌症。错误折叠的单体彼此会缔合形成错误折叠的寡聚物。随后该寡聚物会以淀粉样β-原纤维，无定形聚集体或应力颗粒的形式演变成不溶性聚集体。数十年来的研究已经描述了蛋白质的天然折叠结构或不溶性聚集体中的蛋白质结构、相互作用和活性，但是这两个极端状态下的中间状态还难以直接检测。越来越多的证据表明，这些错误折叠的寡聚物可能在细胞生理学和病理学中都起着关键作用。
活细胞中蛋白质聚集的检测需求促进了一组基于荧光的方法的出现。首先，化学染料（例如PROTEOSTAT分析试剂盒）可以检测细胞内不溶性聚集体。但是，该测定需要细胞固定和膜通透性，因此不适合活细胞。第二，使用荧光蛋白融合或将荧光探针标记到目标蛋白的荧光显微镜和使用代谢标记的拉曼散射显微镜已用于通过观察活细胞中的荧光颗粒来可视化目标蛋白的聚集。由于可溶性寡聚物通常显示出与折叠蛋白相似的扩散结构，因此方法在错误折叠前后均显示光信号，不适合观测可溶性寡聚物。第三，可以量化荧光蛋白融合目标蛋白的扩散常数，以区分不溶性聚集体和折叠蛋白。这样的测定可能不容易将折叠错误的寡聚物与正确折叠的蛋白质区分开，因为两者均显示相似的扩散常数。因此，尽管在过去的几十年中付出了诸多努力，但尚无简单、直接的方法能够在活细胞中检测蛋白质聚集的中间物种，区分错误折叠的寡聚体和不溶性聚集体，以及监测这两个构象之间的转变。
蛋白质的聚集和沉淀会造成局部微环境的变化，包括空间位阻上升造成的粘度增加。基于此美国宾州州立大学张鑫教授团队报道了一系列名为AggFluor的荧光探针，能够对蛋白质聚集过程中粘度的变化精准响应，首次实现活细胞中多步蛋白质聚集过程的可视化成像。作者通过在绿色荧光蛋白的核心生色团4-羟基亚苄基-咪唑啉酮（HBI）中掺入电子密度调节剂（EDR）来控制荧光探针的粘度敏感性，创建一系列荧光探针AggFluorP1-P18，其粘度敏感值几乎均匀地覆盖从0.27到0.68的范围，而具有较低粘度敏感值（类似于P1）的探针应该激活局部荧光在粘度较低的环境中，粘度敏感值较高的探针（如P18）只能在高粘度环境下发出荧光（图1）。
图1：AggFluor探针通过控制错位的可溶性寡聚物和不溶性聚集体的激发态旋转能垒来不同地激活荧光
由于P1同时检测错误折叠的低聚物和不溶性聚集体，而P18仅可以检测不溶性聚集体。随后作者基于P1和P18构建了双色荧光成像技术，报告了超氧化物歧化酶的多步聚集过程，并首次监测到了用MG132处理的细胞中SOD1-A4 V的两步聚集过程（图2）。作者还探究了小分子蛋白稳定调节剂干预蛋白质聚集的过程，发现蛋白酶体的活化剂可以有效消除可溶蛋白多聚体，而蛋白酶体和热休克蛋白活化剂的联合使用可以有效减少不可溶蛋白聚集的产生，从而为蛋白质聚集疾病的药物治疗提供了有效指导。
图2： P1和P18区分活细胞中错误折叠的寡聚物和不溶性聚集体
综上所述，作者通过在绿色荧光蛋白的HBI生色团核心中掺入电子密度调节剂（EDR）来控制粘度敏感性的策略，开发了18种新型的荧光探针AggFluor，可广泛检测对局部粘度的敏感性，直接可视化蛋白质聚集的多步过程。他们使用双色荧光成像技术能够首次区分活细胞中不溶性聚集物的错误折叠的寡聚物，并观察了小分子蛋白质稳定调节剂如何在两种构象状态下驱动蛋白质聚集体的形成和分解，为今后针对广泛性蛋白质错折叠病的治疗探索提供了重要基础。
【文章链接】
https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.0c07245
【DOI号】
https://doi.org/10.1021/jacs.0c07245
【参考文献】
1. Balch W E, Morimoto R I, Dillin A, et al. Adaptingproteostasis for disease intervention[J]. science, 2008, 319(5865): 916-919.
2. Kayed R, Head E, Thompson J L, et al. Common structure ofsoluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis[J]. Science,2003, 300(5618): 486-489.
3. Liu Y, Wolstenholme C H, Carter G C, et al. Modulation offluorescent protein chromophores to detect protein aggregation with turn-onfluorescence[J]. Journal of the American Chemical Society, 2018, 140(24):7381-7384.
【本文作者】
王玉琴
黄硕课题组博士后
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